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【讨论帖】蛋白研究技术答疑专贴
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蛋白质是生命活动最终的控制者和执行者。在分子生物学研究中，往往会陷入一种尴尬局面：DNA编码了RNA，RNA也翻译成了蛋白，但却无法解释蛋白何时、如何、以及为什么被激活，从而承担相应的工作，使生物体表现相应的机能。在蛋白质水平对生物学过程进行研究势在必行。然而，蛋白种类繁多、各有特点，而且难以合成、纯化和保持稳定性，这些瓶颈，制约着蛋白相关研究的开展。
虽然对蛋白质进行研究难度大，但人们攻克难关的决心从未改变。从经典的Western Blot，免疫组化，酵母双杂交，双向电泳技术到现在最热门的蛋白芯片，生物质谱等，对蛋白质表达差异、相互作用、功能以及修饰等各方面进行不断深入的探索。如何很好地利用这些通用的工具，最好地服务于自己的个性化研究，是每个科研工作者最关心的问题。
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【讨论帖】蛋白研究技术答疑专贴
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最新回复
memory (2013-5-21 18:19:16)
yes4 (2013-5-21 18:19:34)
现在很多实验室开始用 genome-wide siRNA screening 掘金了，但就是成本太高。
请问一下目前有没有其他的 High throughput screening 技术用于蛋白质功能的研究？
zhezhe (2013-5-21 18:19:58)
蛋白质电泳之后银染，有些地方说由于上样缓冲液里含有巯基乙醇，会在55或67KDa处出现两条平行的条带，那这个量有没有一个大概的范围？如果目的蛋白是微量的，而且分子量也恰好处于55-72KDa之间，那还有什么敏感的染色方法，如果用银染，那该如何避开这个干扰？DTT是否也会出现这种现象？原理又是什么？谢谢
dongdongqiang (2013-5-21 18:20:16)
大致条件如下：
1、电泳：浓缩胶60V、10min左右，分离胶100V、60min左右；
2、转膜：湿转，100mA、2.5h；
3、封闭：5%BSA+TBST(tween-20浓度0.058%)，室温下、床2h；
4、一抗与二抗按说明书稀释。稀释液与清洗液与封闭液配方一样，均为1.33%BSA+TBST(tween-20浓度为0.025%)；
5、ECL发光法。
结果如图，您能不能给分析下，我个人感觉电泳后的环节出问题。上样量足够、电泳分离得蛮好。谢谢噢。
bring (2013-5-22 12:38:42)
我们现在做的是脂肪组织的WB，有一个解决不了的问题是：测完浓度后（BCA法），按照计算出来的上样量，电泳后显影出来的内参都是有差异的，自己分析了一下，可能是抽提的蛋白中还是有脂类，影响了浓度测量的准确性。
想请教一下，对于脂肪组织的WB，有没有什么好的方法，以确保内参的一致性。
谢谢。
NBA (2013-5-22 12:39:14)
QUOTE:
关于蛋白质相互作用方面的软件有很多，比如cuturl('http://www.bio-soft.net/protein.html') 就有很多关于这方面的介绍，在很多论坛上也有，幸运的话可能淘到一些**的软件。个人认为最好的方式还是通过查找文献来获得蛋白相互作用的证据，因为一些物种整个的相互作用网络已经构建好了并发表在相关的杂志上（比如人，拟南芥，水稻等），很多都有酵母双杂的证据，结果更可靠。另外，像CO-IP, ITC，BIFC等都是研究蛋白相互作用的常用方法了。蛋白修饰方面的软件我就不大清楚了，目前来说，质谱和制作相关的抗体来研究可能是主要的手段了，像short-gun 蛋白组学以及质谱测序等研究方案，和抗体芯片研究磷酸化等信号通路方面等在蛋白修饰方面都是很好的研究手段。
NBA (2013-5-22 12:39:37)
QUOTE:
在蛋白水平能跟genome-wide siRNA screening相类似的方法可能就是化学遗传学(chemical genetics)方法了。它利用化学工具来研究生物体系的一种新兴手段, 它不仅可以在不同时间, 以不同剂量,和进行可逆操作, 为功能基因组研究提供一个检测特定基因或蛋白质功能的手段, 同时, 它也可以在以下两个重要方面促进新药开发: 一方面是鉴定出在某种疾病形成过程中起重要作用的基因或蛋白质, 从而为新药筛选提供靶点; 另外一方面是发现特异性作用于某个基因或蛋白质的小分子化合物, 从而为新药开发提供先导化合物。化学遗传学的研究策略： 1.正向的化学遗传学采用各种小分子化合物处理细胞, 诱导细胞出现表型变异, 然后经过筛选, 寻找小分子作用的靶标。 2.反向的化学遗传学是从基因或蛋白质与小分子化合物的相互作用来研究基因或蛋白质对表型的影响, 从而确定这些生物大分子的功能。 进行化学遗传学研究的关键之一是要有大量的可供筛选的不同结构的化合物。新兴的组合化学是化学 遗传学获得大量小分子化合物的核心技术。它的原理是, 在同一个化学反应体系中加入不同的结构单元, 利用这些结构单元的排列组合, 就能够系统地合成大量的化合物。此外, 现代化学多样性合成技术的改进和发展, 也为化学遗传学奠定了良好的基础。化学遗传学在功能基因组学研究中的应用：
1.寻找酶的抑制剂
2.寻找酶的作用底
3.研究细胞内信号转导
4.研究基因转录
ukonptp (2013-5-22 12:40:08)
QUOTE:
蛋白质相互作用的预测针对不同物种模式生物有许多预测方法，总结网站详见：cuturl('http://www.geneinfinity.org/sp/sp_proteininteraction.html#ppidb')蛋白质修饰的预测针对不同的修饰方法也有许多预测网站，总结详见：
cuturl('http://www.cbs.dtu.dk/researchgroups/PTM.php')
NBA (2013-5-22 12:40:35)
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建议先将电泳后的胶用固定液固定1h 以上，然后用水洗N次后，再进行银染，效果可能更好。另外，银染方法有多种，对不同蛋白有不同的染色效果。
NBA (2013-5-22 12:41:35)
QUOTE:
如果想除去脂类，可以尝试“丙酮沉淀”处理一下样品。NBA (2013-5-22 12:42:03)
大致条件如下：
1、电泳：浓缩胶60V、10min左右，分离胶100V、60min左右；
2、转膜：湿转，100mA、2.5h；
3、封闭：5%BSA+TBST(tween-20浓度0.058%)，室温下、床2h；
4、一抗与二抗按说明书稀释。稀释液与清洗液与封闭液配方一样，均为1.33%BSA+TBST(tween-20浓度为0.025%)；
5、ECL发光法。
结果如图，您能不能给分析下，我个人感觉电泳后的环节出问题。上样量足够、电泳分离得蛮好。谢谢噢。
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从图上结果来看，个人感觉除背景有些深和主带有些虚外，其他都还可以。背景深可能是因为一抗孵育完以后洗膜不彻底，主带虚的话可以尝试适当增加一抗孵育时间。如果目的蛋白的分子量过大不建议使用高电流转膜。个人意见，仅供参考。
nn255 (2013-5-22 12:42:24)
你好，请问用组蛋白试剂盒测试组蛋白乙酰化程度，每个样本至少需要抽取多少的血呢？这些血能不能分离单个核细胞后-80°C保存，以后再批量提取组蛋白呢？
greenbee (2013-5-22 12:42:55)
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想就“丙酮沉淀”请教一个问题：有人用丙酮浓缩蛋白质，但又说浓度过低的时候不能用这种方法，因此就有疑问：既然要浓缩，那就是浓度比较低，如果浓度过低不能选择丙酮沉淀，那大概这个度该是多少？或者根本就没这种限制？谢谢
NBA (2013-5-22 12:43:24)
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关于这个浓度的话，最好在1mg/ml以上。
guagua (2013-5-22 12:43:50)
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您好，请问您那儿有“丙酮沉淀”的相关知识和操作吗？
DNA (2013-5-22 12:44:09)
蛋白质芯片技术的应该越来越广，其中抗体芯片更为成熟，请问目前市面上的抗体芯片有多少种？应用最成熟的是那些？谢谢！
NBA (2013-5-22 12:44:55)
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抗体芯片根据片基不同分为平面微阵列芯片和悬浮液体芯片，平面微阵列芯片代表品牌有Raybiotech、Full moon等，悬浮液体芯片的代表产品有Bio-rad的Bio-plex悬浮芯片系统。
NBA (2013-5-22 12:51:48)
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1 样品中加入5倍样品体积的丙酮(-20度预冷后)，-20度过夜；
2 5000g，4度，离心10分钟；弃上清，待样品中丙酮挥发完后加入裂解液溶解。
个人的小小经验，希望对您有帮助！
fox_79 (2013-5-22 12:52:21)
QUOTE:
在加入丙酮之后是不是就应该把脂肪组织剪碎？用不用超声裂解？还是用破碎仪破碎？另外，5000 g相当于多少的rpm？我们用的是Eppendoff 5810R的低温离心机。
再次感谢。
viviwang1987 (2013-5-22 12:52:57)
大致条件如下：
1、电泳：浓缩胶60V、10min左右，分离胶100V、60min左右；
2、转膜：湿转，100mA、2.5h；
3、封闭：5%BSA+TBST(tween-20浓度0.058%)，室温下、床2h；
4、一抗与二抗按说明书稀释。稀释液与清洗液与封闭液配方一样，均为1.33%BSA+TBST(tween-20浓度为0.025%)；
5、ECL发光法。
结果如图，您能不能给分析下，我个人感觉电泳后的环节出问题。上样量足够、电泳分离得蛮好。谢谢噢。
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"从图上结果来看，个人感觉除背景有些深和主带有些虚外，其他都还可以。背景深可能是因为一抗孵育完以后洗膜不彻底，主带虚的话可以尝试适当增加一抗孵育时间。如果目的蛋白的分子量过大不建议使用高电流转膜。个人意见，仅供参考。"
谢谢版主的建议。我做的目的蛋白分子量分别是57kD和62kD,个人严重怀疑在转膜环节出问题，电转液配置没问题、新鲜，以前用您讲的湿转、低电流100mA、2h，PVDF膜是0.2um，做了DAB结果还不错。那现在准备转膜做回以前的条件，就是低电流100mA、2h，不过想换个0.45um的PVDF膜。那现在请教您，这个膜的选择应该没问题吧？我选择孔径大的膜会不会有渔网拦不住沙子的顾虑？hope 4 ur reply！
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