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【求助】重组质粒变长了?
请教各位大侠:【求助】重组质粒变长了?
我把PCR产物(900BP)和pET32a(5700BP)载体用BamHI和HindIII双酶切,电泳鉴定并胶回收,然用用T4连接酶把它们按10:1的摩尔比16度连接过夜,连接产物同样电泳鉴定均正确。
然后用连接产物转化感受态BL21(DE3),18小时后挑单个菌落做PCR鉴定有目的条带,然后摇菌提质粒,用BamHI和HindIII双酶切,结果发现我提的重组质粒大小约15000个BP,而且双酶切不开,为什么?按理说我的重组质粒应为6600个BP,为什么会变得如此长。
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最新回复
8s5g (2014-3-27 22:56:45)
你用BL21 DE3做克隆?绝对的不可取啊!
我怀疑你用BL21 DE3提质粒的时候提了基因组出来了,所以酶切的是基因组的片段。
先用克隆菌TOP10或者DH5a克隆好了再说吧。因为基因型的缘故,从BL21 DE3里面提质粒很麻烦的
quiqui008 (2014-3-27 22:57:08)
谢谢指点,我本来做了TA克隆的,但是失败了,所以我想直接将目的片断装进表达菌,原来这样做不行,那我再重做TA克隆算了,不过做了TA克隆后还不是要将片断切下来装表达菌,难道那个时候提质粒鉴定也不行吗?
mimili_901 (2014-3-27 22:57:25)
可能是你提质粒提的不好,用试剂盒再提一遍,然后酶切看看
NBA (2014-3-27 22:58:03)
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您的整个概念还是有点混淆。
TA克隆不是用来做表达的(往往),当然也有一些公司做TA的表达载体,但我想你用的应该不是。TA克隆是把片段克隆到一种容易扩增的载体,这种载体通常带有丰富的酶切位点,适合在不同载体之间切换。而且TA克隆很容易,尤其是你的PCR产物比较难得,或者PCR两端的酶切不太好切(比如保护碱基过长等)时,人们往往首先将其克隆到TA载体上,然后测序,以后就只管酶切换载体了。
如果想往表达载体上克隆,有两种情况,一种是你要利用TA载体上酶切位点,这时候尤其要注意好好看看两者的图谱,不要切过去以后造成移框;如果你自带酶切位点在PCR产物两端,那么没关系,直接切了连过去,当然事先也要根据表达载体的阅读框设计好酶切位点。
无论TA克隆还是后续的换表达载体,都属于克隆工作,都是在克隆菌里完成的。
当你得到了你要的克隆(单菌落测序正确后),这时候你要保存这个克隆(质粒和菌),然后提取质粒,转化到表达菌。
Good Luck!
quiqui008 (2014-3-27 22:58:29)
NBA (2014-3-27 22:58:51)
这就是我说的,你先要在DH5a里把克隆全做好,好好看看上面的帖子好吗?
克隆的鉴定有很多方法,比如菌落PCR,Cracking gel,酶切等。请搜索一下。
Bless
quiqui008 (2014-3-27 22:59:08)
NBA (2014-3-27 22:59:44)
QUOTE:
请注意一下上面帖子的斜体部分。quiqui008 (2014-3-27 23:00:08)
NBA (2014-3-27 23:00:34)
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