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【求助】 丙酮沉淀的困惑!
丙酮沉淀都说会丢失蛋白质,可是还有这么多人用沉淀法!【求助】 丙酮沉淀的困惑!
1、到底会丢失多少蛋白质??
2、为什么会丢失???
3、尿素和其他裂解液的成分溶于丙酮吗??如果跟着沉淀下来,会不会影响上样液中各种成分的浓度,进而影响聚焦?
4、丙酮风干不充分,会影响IEF聚焦吗??
5、一般你们沉淀多久???最少多久???
6、丙酮沉淀真的可以去除离子吗?我的标本同样沉淀,为什么有时电压上不去有时上的去?
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最新回复
koook5695 (2013-10-31 20:05:48)
2,有些蛋白质一经沉淀之后难以再溶解.
3,应该不会跟着沉淀下来,至少绝大部分不会.
4,一般5分钟风干足够了,尽量充分.
5,最少2小时以上以沉淀完全,减少丢失的蛋白质。偶常用沉淀过夜。
6,可去除大部分离子,但还有一小部分会跟着沉淀。
张先生 (2013-10-31 20:06:14)
您的丙酮中加DTT吗?有必要吗??
koook5695 (2013-10-31 20:06:43)
QUOTE:
您的问题有难度啊。偶的建议仅供参考,具体还需要您自己摸索。丙酮中可以加DTT,也可以不加。
glass (2013-10-31 20:07:03)
建议还是加,对溶解性有好处.-20度沉淀过夜没问题.
=pkchen= (2013-10-31 20:07:24)
我用丙酮沉淀发酵液的蛋白质,发酵液含有磷酸盐缓存液,用丙酮沉淀后盐含量很高。我做了一个对照试验,将丙酮直接加在一定浓度磷酸盐缓存液中,明显看到白色的沉淀,我感觉丙酮的去盐不好。
INK (2013-10-31 20:07:58)
我倒经常用TCA和丙酮;
Amersham的clean-up kit也是TCA和丙酮,但还有其它的。斑竹或那位知道它有哪些啊?????(kit好贵啊)
koook5695 (2013-10-31 20:08:22)
QUOTE:
您是指KIT的配方吗,不好意思,偶知道的和您一样多,呵呵.张先生 (2013-10-31 20:08:55)
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谢谢你,我也是因为有些怀疑这个才发帖子的。你都用盐溶液试过了,事实胜于雄辩,看来去盐最多只是一部分。
根据你的提示,回头我试试向裂解液中加丙酮,看看尿素等会不会沉淀下来。
另外,丙酮不是夺取水分,蛋白才会沉淀下来吗??所以溶于水的成分必然会沉淀下来。这是我的理论上的推测。(供大家讨论丙酮沉淀的原理)
另外我还觉得,如果裂解液的成分跟着沉淀下来,会影响上样液中各种成分的浓度,进而影响聚焦。
所以我觉得沉淀应该考虑裂解液的成分和浓度。(个人观点,供大家讨论)
张先生 (2013-10-31 20:12:16)
原理,各自特点,以及沉淀过程中注意的问题。
张先生 (2013-10-31 20:12:38)
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对溶解性有好处??表达不太清楚吧??沉淀的目的是使蛋白尽量沉淀下来,“对溶解性有好处”干嘛?我想大虾的意思可能是对沉淀后蛋白的再溶解有好处。
另外,再溶解时上样液中一般不是有DTT吗??丙酮中加DTT到底干什么用??大家讨论。
张先生 (2013-10-31 20:12:59)
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一点建议,不知是否正确,是否对你有用:用超纯水稀释一下溶液,多分装几管,分别沉淀,上样时可以再合并,或许对尽量去除盐有好处。
因为我感觉:是不是盐达到一定浓度之后,再沉淀时,下来的会多。(是否这样?大家讨论,最好是有化学方面专家参与讨论)
finger (2013-10-31 20:13:20)
koook5695 (2013-10-31 20:13:45)
gmjghh (2013-10-31 20:14:04)
凝胶过滤除盐比较麻烦,透析除盐效果有没有简单的判断标准?增加换液次数,透析时间能保证除盐彻底吗?
woshituzhu (2013-10-31 20:15:21)
koook5695 (2013-10-31 20:15:44)
QUOTE:
TCA/丙酮沉淀损失的蛋白是比较多,而且蛋白质比较难重新溶解bling (2013-10-31 20:16:05)
超滤也是办法之一。以前用过,但不是2D。不知那位用到了2D?
xiaoxiaoniao (2013-10-31 20:16:26)
ns5fan (2013-10-31 20:16:45)
0.8ml的样品+0.36ml 1M三氯乙酸,4摄氏度放置10-20分钟,如果效果明显,可以看到絮状沉淀,然后离心,5000rpm,5-10min,时间具体自己掌握,只要沉淀离心下来就好,加1ml丙酮清洗沉淀,除去多余的三氯乙酸,然后干燥,如果觉得沉淀的蛋白不够,可以在加丙酮之前,重复三氯乙酸沉淀步骤。电吹风不需要太长时间,你可以看到沉淀蛋白的颜色变化,其变成粉末状就可以了
张先生 (2013-10-31 20:17:25)
丙酮为什么会影响2D?
真空干燥没有,电吹风要吹多久?我一般超净台风干半小时。
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