质谱沙龙第十期活动报道
2008年7月27日下午，质谱沙龙第十期活动在西苑医院实验楼举行。会议有来自二炮总医院、西苑医院、医科院药物所、朝阳医院、北大医学院、北医三院、空军总医院、AB公司等老朋友，还有来自农业部畜禽产品质检中心、北京生命科学研究所等新朋友。沙龙活动的成员，以前较多的是来自医院的朋友，近来吸引了一批来自农/兽残检测、大分子研究领域的朋友。几种不同应用方向的朋友们，在一起相互分享和沟通，活动气氛更热烈。
多剂量、多次给药复方后LC-MS/MS检测
来自于北京朝阳医院的 张征 老师，做了题为《哌拉西林他唑巴坦钠（4:1）人体药代动力学研究》的报告。
哌拉西林他唑巴坦钠是注射用抗生素复方制剂，内含半合成抗生素哌拉西林钠和β-内酰胺酶抑制剂他唑巴坦钠。由于配方中他唑巴坦钠的存在，增强并扩展了哌拉西林的抗菌谱，使之对许多原先对哌拉西林及其他β-内酰胺抗生素耐药的产β-内酰胺酶细菌有效。因此，该制剂具有广谱抗生素及β-内酰胺酶抑制剂的双重特征，适用于治疗哌拉西林钠/他唑巴坦钠敏感菌引起的下呼吸道感染、泌尿系统感染、腹腔内感染、皮肤和软组织感染、妇科感染、细菌性败血症等。
张老师详细介绍了整个实验的设计、过程和结果。比如，设计了单次给药试验和多次给药试验的流程，血浆样品和尿液样品的采集和处理方法；选用内标兰索拉唑，建立LC-MS方法，测定药代动力学参数等。最后，单次给药试验的结果是：哌拉西林、他唑巴坦体内过程均符合二房室模型。二者t1/2β、Vd、CL不随剂量的改变而改变， C0、AUC0－t和AUC0－∞与剂量呈线性关系。不同性别之间药物的代谢过程无明显差别。 多次给药试验的结果是：哌拉西林、他唑巴坦体内过程均符合二房室模型。连续给药6天后，二者在体内的消除过程未发生明显改变，在体内无蓄积作用。
该报告介绍了一个比较完整的药代动力学实验过程，在场的经验丰富的专家提出了很多不错的建议。同时，其它应用方向的同仁们也提出了几个比较有意思的问题，张老师都一一给与了解答，小结在此，可以折射出各应用方向之间的一些差异：
（1）有些老师提出，该实验的动态范围是0.10～100 μg/mL，其实用液相色谱也可以满足。为什么要用液质联用？
张老师等医院的老师的回答是：主要原因是省时。虽然购买一台液质最初投入的成本比较高，但是整个实验用液质做的时间会比较短（比如液相一个药动实验大概要2～3周，而液质只用大概1周时间）。
（2）只用有机溶剂沉淀蛋白的前处理方法是否太简单了？是不是应该用更干净的液-液萃取或固-液萃取（SPE）？其实，SPE只有十几块钱一根啊。
张老师等医院的老师的回答是：首先从成本考虑，在建立方法时，首先先试着建立沉淀蛋白处理的方法，只要能做出来（满足药动要求），就用该方法。这些项目跟国家拨款的科研项目或监控项目不同，成本能降一点就降一点。同时，平时也要注意色谱柱的保护，至今这个方法里用的色谱柱还是去年的一根。有些老师还介绍，有些实验干脆直接用预柱做，脏了换柱芯即可。
其次，沉淀蛋白法虽然处理步骤很简单，有可能基质效应比较强，但简单的步骤可能产生的未知的问题也就较少。而液-液萃取或固-液萃取，步骤都比较多，也会带来很多潜在的问题。
（3）在线性曲线中，最高一点为什么会偏离比较远？
张老师等医院的老师的回答是：这个问题没有特别好的解决办法。比如，如果在倒数第二点和最后一点之间增加一个数据点，可能会有所改善，但又会影响整个曲线。不过在药动实验中，一般采用加权平均法，低浓度点的偏离对结果的影响会更大；所以，虽然最后一个点看起来有点偏离曲线，但其实影响不大，都符合RSD <15%的要求。
相关下载：多剂量多次给药复方后LC-MS/MS检测
体内药物分析综述
来自二炮总医院的 李鹏飞 老师，是活动的主要组织者之一，已经准备好了一个非常好的题目，便于增进各应用学科之间的沟通。李老师毕业于吉林大学，已经有比较丰富的药代动力学和液质联用的使用经验，来到二炮医院后，马上投入“中毒急救中心”的项目，并成为主力。两年来，开展了约150例药物中毒检测，大约有100多例，都可用LC-MS/MS方法快速判定中毒原因，为临床处理突发性急性中毒事件提供决策参考和依据。比如以前曾介绍过的卡马西平、安定药物中毒的实例，都非常有代表意义。
这个综述性的报告系统而且全面，同时，李老师也融入了很多自己工作的体会，并引发大家的共同讨论。比如：
（1）血样的检测分全血、血浆和血清，它的采集不可忽视，如果第一步没有处理好，将会给后面带来无穷的干扰。目前，二炮总医院已经指导护士们使用一次性的、带定量刻度的负压全血采样器。
（2）关于为什么要用内标法：相关规范中，的确没有硬性规定必须使用内标法，只是建议“尽量采用内标法”。对某一个方法来说，建立外标法，很多时候也可以获得不错的结果；但是，如果更换了一批样品，由于内源干扰等许多复杂的情况，就可能失败，这时内标法就体现出抗干扰能力强的优势。李老师就给出了一个例子，原来用外标做得很好，但是后来换了一批样品，怎么也通不过，只好推倒重来，重新建方法。当然，找内标的标准品确实麻烦一些，一般会选择几个比较通用的内标物，平时积累它们的有关特性，应用于大部分实验。这些选择都要依赖于自己长期的经验判断。当然，相比农/兽残检测的朋友们，药物分析所需要的内标物，要容易找得多。因为农/兽残的内标标准品都不是批量生产的，所以会非常昂贵。
（3）很多人在讨论“回收率”问题。在药物分析中，的确是有“相对回收率”和“绝对回收率”的区分，不少朋友们还在网上讨论了很多。有些朋友建议废止“相对回收率”一说，因为它跟“准确度”基本是一样的。的确，在农/兽残检测中，只有相当于“绝对回收率”的“回收率”的说法。当然，也欢迎大家继续讨论。
相关链接见：绝对回收率和相对回收率
（4）关于前处理方法，做蛋白质组的一些朋友们也提出用丙酮沉淀蛋白，或DTT抗氧化等处理的一些方法。可能会给药物分析的朋友们一些启发。
经过综述性的概括和大家的讨论，在场的多数成员认为，样品前处理问题是一个非常重要的问题，比后面仪器的影响要大得多，实验的成败很多取决于前处理。分析测试百科现有“样品前处理”群组，今后也会更多地关注这样的话题。
相关下载：体内药物分析综述
蛋白质构象以及分子间非共价相互作用的冷喷雾质谱研究
来自协会药物所的 郭娜 博士，介绍了她们的实验室（医科院药物所仪器分析中心），用CSI-MS方法表征大分子的构象和研究非共价相互作用。
郭娜首先介绍了研究的意义：蛋白质的结构与其功能有着紧密的联系。蛋白质通过分子内非共价键作用折叠形成蛋白质高级结构；同时蛋白质还常与其它分子形成非共价复合物，这些都是蛋白质行使不同生物功能的基础。因此，表征蛋白质构象及其复合物结构是从分子水平上阐述生命现象、药物机理的重要基础，并可为药物筛选提供依据。 其次，郭比较了各种表征手段，有些方法比较简单，但提供信息少；有些方法提供信息多，但却制备复杂，对样品的量、纯度等要求很高。因此，引出了ESI-MS质谱法在表征构象和研究非共价作用中的优势。但即使用ESI-MS，仍然有一个困难：液相中稳定存在的构象与气相中是不同的，同时ESI离子化技术的高温高压等剧烈条件不适合非共价相互作用的维持。运用质谱技术表征蛋白质的溶液蛋白质构象及非共价相互作用，关键在于其离子化过程是否能够尽可能地保持蛋白质在溶液态的结构。由此引出了新技术——冷喷雾质谱（CSI-MS）技术。
据悉，郭的导师再帕尔教授，是有着几十年经验的质谱专家，近期利用冷喷雾质谱技术开展了分子间非共价弱相互作用、蛋白质构象等国际前沿性课题，并获得了突破性进展，建立了可直接在线检测动态结构变化的表征弱键化合物体系的分析方法。
接着，郭系统地介绍了她的实验，选择细胞色素C，在pH 2.5的乙酸－水体系，重点考察了在CSI-MS谱测定中喷雾电压、锥孔电压、喷雾温度等关键仪器参数对于表征蛋白质构象的影响。结论是：锥孔电压和喷雾温度的影响比较明显。然后，比较考察了在不同pH值下细胞色素C的ESI-MS和CSI-MS，显示在整个pH范围（pH2.5-11.0)范围内，CSI-MS谱平均电荷价态明显低于ESI-MS,从而很好地说明了CSI-MS方法能更好的维持蛋白折叠构象。接着，用CSI-MS方法定量分析细胞色素C折叠平衡转变，并扩展到研究泛素、肌红蛋白、亲环蛋白的构象和非共价复合物；利用CSI-MS方法表征了Aβ与抗AD活性天然产物DHB形成的非共价复合物结构，同时证明DHB能够在一定程度上抑制Aβ蛋白的聚合，为解释其药效作用机制提供了一定科学依据（注：Aβ蛋白代谢异常会引起老年痴呆）。探索并建立了有机盐类药物快速、简便的CSI-MS新检测方法，实现了有机盐类药物形成整体簇合物结构的质谱表征。
由于CSI-MS是一种新技术，其应用前景有待研究者继续开拓；而用质谱法研究大分子构象和非共价相互作用，一直是前沿并且难度较高的课题，所以，大家都听得兴致盎然，并对更好地设计实验方案、更充分地展现CSI-MS技术的特点和研究潜力，提出了很多有益的建议。
相关下载：蛋白质构象以及分子间非共价相互作用的冷喷雾质谱研究
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稳定同位素标记的定量蛋白质组学
来自北京生命科学研究所蛋白质中心的龙承祖 老师，介绍了蛋白质组学前沿的定量蛋白质组学技术。龙老师的演讲风格非常有特点，语速快、有激情、ppt中往往配有各种极其形象的动画，很有感染力地把故事的来龙去脉讲得非常清楚，所以虽然时间渐晚，但听众们都听得津津有味。
他的片子往往在一开头，给出一个非常震惊人的论断，比如这次他又首先引用了马里兰大学的Catherine Fenselau的语录：“质谱是一个定性的技术，不是一个定量的技术。“对于在场的众多来自医院的、几乎专门用质谱做药物定量的听众们来说，绝对是个震撼！忍不住要继续听听这个个头不高的年轻小伙儿下面到底倒出些什么，以待反击。接着，小龙老师道出了原因：因为不管是ESI或MALDI离子源，都对分子有些自己的偏好，所以，质谱的峰高并不和蛋白量有绝对的关系，同等量不同的蛋白分子，在质谱上的响应是不同的。所以要用内标。” “记得刚才大家讨论小分子定量时的内标问题，现在蛋白这个大分子在质谱中是以裂解后的肽存在的，所以呢，最好是对每个肽都使用内标。” 这时，估计在场的诸位都更困惑了，一个小分子的内标已经很难找了，何况对蛋白的每个肽都找内标！“最好的内标就是自己，不过如果完全是自己，那在质谱中的峰就重合了。所以，同位素标记一下自己，是比较可行的方法。”小龙老师随后列举了大牌的几位科学家（顺便还给他们起了个中文名）：发明N15标记定量法的John Yates（江叶慈）、发明ICAT标记定量法的Ruedi Aebersold（儒帝），和发明SILAC的Matthias Mann（马提亚）。下面开始正式介绍了各种同位素标记的蛋白质组定量方法（SILAC、N15、iTRAQ、ICAT等其它）。注：还有其它的一些定量方法，小龙老师由于时间关系没有介绍。
N15和SILAC方法，形象地比喻，都是用含稳定同位素的“饲料”去“喂养”细胞或个体，其中，SILAC方法还更聪明些，它标记的是细胞必须从外界摄取、自身无法合成的、必需的氨基酸，所以，标记的效率会很高。同时，配合蛋白质组学中最常使用的胰蛋白酶（Typsin）来标记赖氨酸（Lys），可以更方便地解析谱图。因为含有Lys残基的每个肽段都只含一个标记物，质量变化是唯一的。
化学标记技术iTRAQ比ICAT改了很多（原来的ICAT只能标记半光氨酸，只能同时标记两个样本）。iTRAQ试剂盒含四种试剂，可同时标记四个样本，标记后的肽和未标记的肽一级质谱相同（有效地降低了谱图解析的复杂度），二级质谱显示了报告的114Da、115Da、116Da和117Da的离子（谱图也容易解析），标记效率提高，并可同时定量多个样本。
最后，小龙老师还推荐大家尝试一下18O技术，蛋白质酶切时或酶切后放入H218O中，在蛋白酶的催化作用下，羧基上的2个氧换成18O。它比较简单易行，应用广泛。
相关下载：稳定同位素标记的定量蛋白质组学
其它相关：定量蛋白质组学
结语：质谱技术在近年来几乎是增长最快的技术，应用于越来越多的领域。质谱沙龙活动，联系不同应用领域的研究者、专家和朋友们，相互沟通、广泛讨论、彼此分享，并促进了用户和厂家的相互沟通，促进了大家仪器使用和应用水平的提高。
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