【讨 论】分泌表达，蛋白质N端少了几个氨基酸！

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• nvdabing (2014-2-03 23:36:06)

  
  好专题，实验室可能出来的蛋白有活性就无所谓N端完不完整，但是做成药就需要结构上确证。我们做的一个蛋白酵母表达后，纯化测序就出现了N端的缺失，缺失还不是两三个AA，测序的结果根本就是无法判断究竟是不是我们要的蛋白。楼主觉得这种N端的缺失主要是被当成信号肽切掉了吗，是否还有些其它机制（查过一些文献，没找到）？先看看楼主提供的文献。
  另外，请问楼主，除了您提供的文献外还有没有其它可防止N端缺失的文献报道（有点小贪心，呵呵）

• qumm1985 (2014-2-03 23:36:33)

  
  可防止N端缺失的文献报道
  个人认为。具体问题具体分析了。
  防止N端缺失可以通过菌种做特定基因的knockout. 或 disruption of gene
  1，先要找到是哪个酶起作用把N端的氨基酸切掉了。很难做到，但必须的。
  2，knockout. 或 disruption of gene
  3，但knockout. 或 disruption of gene有时候又会使蛋白不能分泌表达了。
  许多东西我也不是懂。

• nvdabing (2014-2-03 23:36:59)

  
  N端缺失的问题看来平时遇到的人不多，关注的人这么少。
  通过确定哪个关键酶起作用，然后将其knock out掉，这个工作量不是一般的大呢。而且方案的切入点都不好找（特别像我遇到的不均一的缺失）。不知道有没有专门针对N端的酶。问下楼主，信号肽或者好多真核生物Met的切除是特异性的酶起作用吗？（这方面的材料还没了解过）

• nvdabing (2014-2-03 23:37:16)

  楼主，您的蛋白最后65%的蛋白N端别切掉是怎么分析的，质谱的结果还是通过测序的结果分析？另外，寻找相应的酶做knock out工作量现在对我们来说有点大的，我们现在尝试在蛋白的前面加上其它一段保护序列，然后加入一个蛋白酶（如肠激酶）酶切位点，准备通过酶切的方法试试，结果还没出来

• jingling845 (2014-2-03 23:37:36)

  
  可以换个信号肽试试,我记得在pichia中可以使用一种信号肽避免N端的不完整,有具体文献,但我不是做上游的,记不清了.再找找......

• jingling845 (2014-2-03 23:37:57)

  
  应该是这篇
  Functional phytohemagglutinin (PHA) and Galanthus nivalis agglutinin
  (GNA) expressed in Pichia pastoris
  Correct N-terminal processing and secretion of heterologous proteins expressed using the PHA-E signal peptide
  Romaan J. M. Raemaekers, Laura de Muro*, John A. Gatehouse and Anthony P. Fordham-Skelton
  Department of Biological Sciences, University of Durham, South Road, Durham, DH1 3LE, UK

• qumm1985 (2014-2-03 23:38:27)

  QUOTE:

  原帖由 nvdabing 于 2014-2-3 23:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  楼主，您的蛋白最后65%的蛋白N端别切掉是怎么分析的，质谱的结果还是通过测序的结果分析？另外，寻找相应的酶做knock out工作量现在对我们来说有点大的，我们现在尝试在蛋白的前面加上其它一段保护序列，然后加入一个蛋白酶（如肠 ...

  是测序的结果。
  如果尝试在蛋白的前面加上其它一段保护序列，然后加入一个蛋白酶（如肠激酶）酶切位点，准备通过酶切的方法试试
  酶切得到目的蛋白的话N端会多出几个氨基酸的。不知道您表达蛋白的目的什么。做药的话，多出几个氨基酸来，可以吗？

• jingling845 (2014-2-03 23:38:53)

  
  合理设计的话应该是可以避免多出氨基酸来的吧，但是酶切的话条件比较难控制，特别是像肠激酶之类的，虽然有特异的酶切位点，但是如果酶量不合适或者温度不合适会有非特异的酶切产生，总是先试试看，呵呵。另外谢谢楼主提供的资料

• qumm1985 (2014-2-03 23:40:28)

  
  肠激酶
  1，价格贵，2，下次你用的话，不要用国产
  3，酶切的条件要好好的摸索。

• bling (2014-2-03 23:40:49)

  我用的是酿酒酵母表达系统来分泌表达的情况和大家交流：我表达的是分子量为3000-6000的多肽，已表达出6-7个，分子量通过质谱鉴定完全符合，但也有几个就是不能表达出来，也有表达出来的是N端缺失长短不同的几个氨基酸残基（由质谱推断）组成的混合物。我想造成此结果的可能原因：（1）、表达产物本身不稳定，在酵母表达过程中容易降解；（2）在表达过程中的成熟肽的可变切割。
  至于jingling的“在蛋白的前面加上其它一段保护序列，然后加入一个蛋白酶（如肠激酶）酶切位点，通过酶切的方法获得目的蛋白”我认为通过酶切和多步纯化，最终你的目的蛋白量可能比较低。

• jingling845 (2014-2-03 23:41:50)

  合理设计的话应该是可以避免多出氨基酸来的吧，但是酶切的话条件比较难控制，特别是像肠激酶之类的，虽然有特异的酶切位点，但是如果酶量不合适或者温度不合适会有非特异的酶切产生，总是先试试看，呵呵。另外谢谢楼上提供的资料

• qumm1985 (2014-2-03 23:42:14)

  肠激酶
  1，价格贵，2，下次你用的话，不要用国产
  3，酶切的条件要好好的摸索。

• leifengta (2014-2-03 23:43:40)

  我用的是酿酒酵母表达系统来分泌表达的情况和大家交流：我表达的是分子量为3000-6000的多肽，已表达出6-7个，分子量通过质谱鉴定完全符合，但也有几个就是不能表达出来，也有表达出来的是N端缺失长短不同的几个氨基酸残基（由质谱推断）组成的混合物。我想造成此结果的可能原因：（1）、表达产物本身不稳定，在酵母表达过程中容易降解；（2）在表达过程中的成熟肽的可变切割。
  至于barenxm的“在蛋白的前面加上其它一段保护序列，然后加入一个蛋白酶（如肠激酶）酶切位点，通过酶切的方法获得目的蛋白”我认为通过酶切和多步纯化，最终你的目的蛋白量可能比较低。

• jingling845 (2014-2-03 23:43:58)

  
  通过酶切再纯化，最终蛋白得率肯定是低的，在上游突变相应的酶或发酵工艺上下功夫抑制这种N端的缺失才是王道呀，呵呵。只是觉得目前的基础，这方面的基础研究还不是很多，我们通过酶切纯化也是先试试，确定我们表达的蛋白活性怎样。lpjiang2000，3000-6000这样的短肽酵母中好表达吗？看你表达了这么多了

• dreaming (2014-2-03 23:44:17)

  
  我正在试图寻找能用这个酿酒酵母表达的基因的一些共性或者表达产物的一些共性。表达3000-6000 Da还算满意，这个系统有时也不稳定，但纯化还算方便。酵母表达受多个因素的影响，我目前还是停留在实验室阶段，如果用大规模的工业化生产，情况怎样？还不好说。

• mamamiya (2014-2-03 23:45:37)

  大家好，我也用毕赤酵母表达了一个6000左右的小肽，但是在分离纯化时，培养基的色素影响很大，不知大家有没有遇到这样的问题，大家都是怎么来除色素的啊？谢谢！
  顺便问一句，大家的表达量是多少啊