【求助】请教高手给分析下非特异性扩增的原因

最新回复

• bs4665 (2015-4-03 09:59:28)

  
  您好楼主，我想问一下您这图片是用自动成像系统扫描上去的？还是用相机照出的？谢谢。

• mimili_901 (2015-4-03 09:59:44)

  
  每种引物都有自己最为特异的反应条件，你做这个的目的是什么....

• 二丫头466 (2015-4-03 10:00:00)

  
  自动成像的，还请高手给分析一下非特异扩增的原因，怎么弄才清楚
  

• mimili_901 (2015-4-03 10:00:19)

  QUOTE:

  原帖由 二丫头466 于 2015-4-3 10:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  自动成像的，还请高手给分析一下非特异扩增的原因，怎么弄才清楚
  

  拍出的照片 都这么小吗 可以调节成大图片啊 在拍照时候

• babybabe (2015-4-03 10:00:37)

  
  你目的条带是多少~

• 二丫头466 (2015-4-03 10:00:55)

  我是新手，也不知道要几条，只是想让条带清晰

• okhaha (2015-4-03 10:01:13)

  有很多原因，
  1、胶的问题
  2、引物特异性不强，
  3、PCR条件不合适，
  4、跑胶时间太长，
  5、酶的特异性不好，可以试试primer start等
  建议楼主在探索以下条件吧

• vcve (2015-4-03 10:01:30)

  
  我看你的片段大小不一，推测可能是引物的Tm值不同，你用同一个温度退火的话可能会出现这样情况。你的模板是不是基因组？你如果想一起扩增，你尝试用Touch Down PCR做下，试试从64℃~58℃
  

• vcve (2015-4-03 10:01:55)

  一般非特异扩增的原因比较多，诸如：模板过量、循环次数太多（25~35比较适宜）、酶用量过大、引物特异性不好；很有可能是引物自身设计的问题，特异性不好

• youyou99 (2015-4-03 10:02:31)

  非特异性条带的根本原因还是引物的3`端于其他的模板位置发生了anneal，用NCBI的primer-blast可以检测引物的特异性。Touch down PCR也是个方法，但是也要看3`端和非特异模板匹配位置的TM值，如果这个TM值很高，TOUCH down也是不能解决问题的。至于高保真酶，是无法消除非特异性反应的。

• 33号 (2015-4-03 10:02:54)

  主要是退火温度和引物的问题，建议提高下退或温度，降低下模板的量或者降低引物的加量，再不行就得重新设计引物了

• finger (2015-4-03 10:03:09)

  
  应该是有非特异性扩增吧，重新设计引物试试

• 短头发 (2015-4-03 10:03:32)

  
  不用引物如果退火温度不一样，一般不能在一起P的，这样很容易产生非特异扩增，你应该按照每个引物的Tm值设定其合适的退火温度，分别做PCR，结果应该会好点。

• flower-201 (2015-4-03 10:03:49)

  引物特异性可能不是很高，条带大小也不一样，先升高退火温度试试。