【转帖】肝星状细胞实验步骤

字体: 小中大 | 打印发表于: 2015-8-10 16:47 作者: 箭头儿来源: 分析测试百科网

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实验步骤如下
小鼠3%戊巴比妥钠腹腔麻醉。
以“U”型切口打开腹腔。将肠管推向腹腔左侧，暴露门静脉及下腔静脉

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箭头儿 (2015-8-10 16:48:12)

剪一小口，将充满灌流液的针头经小口插入门静脉，止血夹夹住

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箭头儿 (2015-8-10 16:48:29)

打开恒流泵的开关开始灌流，并迅速剪断下腔静脉。肝脏在灌注开始几秒内变成黄白色（灌注结束的时候，肝脏上可见白色纹理）。

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箭头儿 (2015-8-10 16:48:46)

灌流结束，将肝脏移至培养皿中，加入少量（5ml左右）solutionII，显微镜下尽量去除胆管和血管，剪碎肝组织

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箭头儿 (2015-8-10 16:49:03)

将搅碎的肝组织倒入50 ml的离心管，加入solutionII至30ml，加入胶原酶，pronase和DNase，37度水浴消化12 min。（如果前面的灌注不好的话，可以适当延长消化时间）

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箭头儿 (2015-8-10 16:49:21)

消化结束的时候能够看到部分未消化完的肝组织。（不知道其他战友们消化的时候是否也是如此）

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箭头儿 (2015-8-10 16:49:42)

加入15ml血清终止反应。70μm过滤网过滤。
20G，4min离心，去除肝细胞（因为肝细胞重，所以会低速离心也能够沉下去）
收集悬浮液，450G，7min使悬浮液中的细胞都沉下去。吸掉悬浮液，加入15%optiprep，充分吹打，在其上轻轻加入5ml11.5%optiprep和5mlGBSS

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箭头儿 (2015-8-10 16:49:58)

1400G，17min 离心。
GBSS和11.5%optiprep间能够看到浅白色的条带

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箭头儿 (2015-8-10 16:50:16)

轻轻收集中间GBSS和11.5%optiprep间层5ml，加入5mlGBSS 450G，8min离心。吸掉悬浮液，加入适当的DMEM培养液，计数，培养
由于是拿手机拍得照片，可能不够清晰，请谅解。
mybioon (2015-8-10 16:50:34)

高手，小鼠也能插管，我的大鼠每次插管都容易脱管，惨啊，谢谢你的图片，很有参考价值
dodoit (2015-8-10 16:50:54)

这个不难，多练习几次就好了。
插管可以用线绑住固定，或者用止血夹夹住。
lyxsqs (2015-8-10 16:53:14)

楼主，你在动物房做不怕被污染的吗？
箭头儿 (2015-8-10 16:54:01)

相关疾病：
痛风
1。相对来说，我们动物房的中央空调很好的运转，通风比较好，没有那么脏。
2。我是灌流结束后的水浴锅开始是在另一个实验室。
3。我个人觉得，污染发生在开始培养后的操作不当，或者比如恒温箱等原因。因为第一步在体灌流不可能做到无菌，肯定会暴露到空气中。所以这一步会有一定的空气中的细菌进入你的系统当中。但是从灌流结束开始，进行了严格的无菌操作，所以一开始的那部分细菌会在各个操作过程中，越来越稀释。比如，一开始你在体灌流的时候有10个细菌贴附到你的肝脏，那么经过中间很多步操作，到最后你把细胞加入到培养基的时候，可能就只剩下1个或2个。然后还得看这个细菌是否适合在你的培养基条件下生存，能否抵抗你的培养基中的双抗的攻击，等等。所以，一开始所进入的污染相对来说影响没有那么大。
个人体会，请指教，谢谢。
baidukk (2015-8-10 16:54:30)

好贴！强烈同意TK兄的说法，开始无菌确实很难，不过也无妨。
也贴一张图，支持一下做HSC的同胞

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龙小好汉 (2015-8-10 16:54:55)

谢谢两位分享经验。liangyuejin，黑色的小鼠是C57吧？
楼上，是否可以贴一张刚刚接种下去的细胞的图片呢？
龙小好汉 (2015-8-10 16:55:11)

在细胞得率上，我有一点体会：就是在密度梯度离心之前，尽可能的得到单细胞悬液.
DnaseI的作用很关键，可以将细胞团块分散。
我的经验是，有一次取分层细胞的时候，不小心将枪头调入离心管中。分层被底部沉淀打乱，取出枪头后重新梯度离心，分层消失。
baidukk (2015-8-10 16:55:28)

说的很对，单细胞悬液很重要的，我也有同感
黑的小鼠是C57 的，以前拿来做门静脉穿刺练习的，刚开始操作失败很多次哦
龙小好汉 (2015-8-10 16:56:03)

现在楼上的SOP成了大家的主要参考，但是我有两个疑问：
1）消化液是链霉蛋白酶E加DNaseI。为什么不加一点胶原酶？如果加的话，浓度多少合适？
2）在消化后，有加入含血清的培养基终止。胶原酶的消化真是可以被终止吗？
箭头儿 (2015-8-10 16:56:30)

QUOTE:
原帖由 龙小好汉 于 2015-8-10 16:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

现在楼上的SOP成了大家的主要参考，但是我有两个疑问：
1）消化液是链霉蛋白酶E加DNaseI。为什么不加一点胶原酶？如果加的话，浓度多少合适？
2）在消化后，有加入含血清的培养基终止。胶原酶的消化真是可以被终止吗？ ...
1. 我的方法上，消化液从来都是有胶原酶的阿。呵呵，兄弟再看看我的protocl吧。
2. 血清本身不是抑制胶原酶的活性，而是通过降温和稀释来中止消化。所以我平时终止消化的是放在4度的含有血清的DMEM。
baidukk (2015-8-10 16:56:53)

果然如此，消化液是用solutionII配制的。
请问选择I型有其他的文献支持吗？因为我看在大鼠用的几乎都是IV型。
箭头儿 (2015-8-10 16:57:14)

QUOTE:
原帖由 baidukk 于 2015-8-10 16:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

果然如此，消化液是用solutionII配制的。
请问选择I型有其他的文献支持吗？因为我看在大鼠用的几乎都是IV型。
我是自己用collagenaseI和IV 做了平行比较后选择了I的。