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之前写过一个小软件，辅助设计miRNA荧光定量PCR茎环引物，现在拿出来跟大家分享一下。
以hsa-mir-224（CAAGUCACUAGUGGUUCCGUU）为例写一下茎环引物设计方法：
我采用的茎环序列是：5' GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC3'
pcr通用下游引物: 5' CAGTGCGTGTCGTGGAGT 3'输入hsa-mir-224序列及茎环序列，茎环尾加长度一般为7或8，点击确定，如下图所示：
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27678778.snap.jpg
最新回复
PCR (2016-1-05 15:56:22)
将模板序列的第一条序列、miR-224浅红色序列及2个深红色碱基序列、通用下游引物复制粘贴至进去，如下图所示
87040254.snap.jpg
PCR (2016-1-05 15:57:50)
修改参数：
88625056.jpg
PCR (2016-1-05 15:58:30)
95311266.jpg
23073642.snap.jpg
PCR (2016-1-05 15:58:53)
85839439.snap.jpg
PCR (2016-1-05 15:59:11)
42984525.snap.jpg
PCR (2016-1-05 15:59:46)
yonger (2016-1-05 16:00:10)
试着用楼主的软件用了一下，很有用。只是还有些问题（因为是新手，所以有些问题没有办法处理）：
1、引物5'端增加GC含量来增加Tm，但加了6个G才出现合适的TM值？最多可以加多少？
2、WARNING: Left primer is unacceptable: Unacceptable GC content/Long poly-X，该怎么处理？
3、有的引物Tm too HIGH，该怎么处理？
望指导！谢谢！
PCR (2016-1-05 16:00:35)
QUOTE:
1、最多可以无限加2、有时候受限于miR的序列无法设计成完美的引物，可以直接取miR序列做引物即可，不过要去掉外部与逆转录引物互补的7个碱基序列
3、加AT
wawa (2016-1-05 16:00:51)
楼主你好！你这个帖子的茎环序列，我在你其他帖子中也看到了，想必你们实验室用该序列效果是挺好的了。请问你用该茎环做的是什么物种？
PCR (2016-1-05 16:01:15)
人，其它物种也可以使用，与物种无关
ns5fan (2016-1-05 16:01:33)
楼主，我想请问下，你的这个茎环序列是怎么确定的呢。你的这个反转录用的内参是哪个，U6吗？GAPDH可以用吗？因为是新手，所以好多问题都不太清楚。
PCR (2016-1-05 16:02:00)
QUOTE:
序列是文献报道的，当然你也可以自己设计可以用U6。GAPDH是mRNA的内参
duchy (2016-1-05 16:02:43)
谢谢，楼主，内参U6的引物需要怎么设计
PCR (2016-1-05 16:03:05)
QUOTE:
文献中找现成的，无需设计PCR (2016-1-05 16:03:27)
mogu (2016-1-05 16:03:41)
想请教一个问题。由于miRNA序列的特异性，为避免引物二聚体的ΔG过大，茎环尾加长度需要设为9。请问，你有没有使用过这么长的茎环尾加长度？你估计这样设计行得通不？
PCR (2016-1-05 16:04:04)
QUOTE:
一般尾部加8个，9个也可以。6327555 (2016-1-05 16:07:03)
以hsa-mir-224（CAAGUCACUAGUGGUUCCGUU）为例写一下茎环引物设计方法：
我采用的茎环序列是：5' GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC3'
pcr通用下游引物: 5' CAGTGCGTGTCGTGGAGT 3'输入hsa-mir-224序列及茎环序列，茎环尾加长度一般为7或8，点击确定，如下图所示：
下一步设计PCR上游引物，我利用的是primer 3.0在线引物设计软件，网址为：cuturl('http://primer3.ut.ee/')
将模板序列的第一条序列、miR-224浅红色序列及2个深红色碱基序列、通用下游引物复制粘贴至进去，如下图所示
需要注意的是，上游引物与尾加序列重叠长度不能超过2个碱基，以防止上游引物直接跟残留的逆转录引物结合并扩增
修改参数：
点击“Pick Primers”按钮
提示上游引物Tm太低，我们可以在引物5'端增加GC含量来增加Tm，如下图所示增加四个g，增加gc时以不产生发卡结构为准
然后点击“Pick Primers”按钮
这样上游引物就可以使用了， 即：ggggCAAGTCACTAGTGGTT
附件是上面提到的小软件，欢迎下载，该软件免费、免安装
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楼主，首先非常感谢，最近正在做血浆miRNA的定量检测，qPCR跑出来效果都不是很理想，估计与引物设计有关，请问：1.如果用你的软件设计的引物Tm值太低时，G与C的顺序与各自的数量是随便加的吗，加的怎么防止发卡结构（不是很懂）；2.如果是引物Tm值太高，加A与T各自的碱基数也是随便加的吗？也是在5'端加吗？3.前向与反向引物的GC含量一般保持在多少最合适，一定要相差很近吗？在线等您的回答，谢谢！
PCR (2016-1-05 16:07:28)
QUOTE:
1、比如miRNA序列中连续的CCC比较多，那么你就不能再在5‘端增加GGG，而是增加CCC；你增加CG后如果有发卡结构，软件也会提示的2、可以加，只能在5’端加
3、主要看TM值，两个引物接近为主
但是有时候难以设计出非常理想的引物，即使primer 3.0提示引物存在问题，照样可以扩增的
PCR (2016-1-05 16:17:10)
2、可以加，只能在5’端加
3、主要看TM值，两个引物接近为主
但是有时候难以设计出非常理想的引物，即使primer 3.0提示引物存在问题，照样可以扩增的
......
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非常感谢您的回复，神速啊，你的回复很有用，已经摸索一个多月了效果还是不好，有两个目的基因扩增不出来，主要原因可能还是血浆miR浓度太低，不知楼主有没有做过血浆的miR定量，有没有好的指导方法？跪谢~
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