液相色谱柱的使用与维护
☆ 液相色谱柱的安装
液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。
1、液相色谱柱的结构：
a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。
柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件。在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。
b、柱填料：
液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。
正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3—10 µm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。
反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。
常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒的粒径在3—10 µm之间。
2、色谱柱的安装：
a、拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。
b、拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。
c、
按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止，再用扳手继续顺时针拧1／4-1／2圈，切记不要用力过大。如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象，请用扳手继续顺时针拧1／4圈，直至不漏液为止。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2.5mm长或其他固定尺寸)。
☆ 液相色谱柱的使用
色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。
1、样品的前处理：
a、最好使用流动相溶解样品。
b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
c、使用0.45µm的过滤膜过滤除去微粒杂质。
2、流动相的配制：
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：
a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
3、流动相流速的选择：
因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。
当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
☆ 液相色谱柱的日常维护
(1)每次开机时，流速和柱压要逐渐增加，突然迅速增加，会使柱床受到冲击，引起紊乱，产生空隙
(2)在进样前使色谱系统充分平衡，是否平衡可由基线加以判断
(3)在进样前，检查色谱系统的各个接头，通常由此能发现是否有漏液现象。如有漏液，空气会从漏缝 进人系统引起基线漂移，影响峰高和峰面积的重复性
(4)不要把柱接头上得太紧，否则易损坏接头螺纹，引起渗漏
(5)不要把柱子放在有气流的地方或直接放到阳光下，气流和阳光都会使柱子产生温度梯度造成基线漂 移；如果怀疑基线漂移是由温度梯度引起的，可以设法使柱子恒温（配柱温箱）
(6)若仪器用做常规分析，样品种类有限，但分析次数很多，则不妨为每一类常规分析配置一根专用柱， 这样有助于延长柱寿命
(7)如果怀疑样品会污染色谱柱，可以用合适的溶剂(几百毫升)慢慢冲洗柱子过夜，第二天早晨再用流动相重新平衡柱子(约3min)
(8)在因装卸、更换、贮存等而挪动柱子时，动作要轻，不要使其受到碰撞，以免柱床因震动产生空隙或通道
(9)柱要加标签，新旧分开，不要放在温度变化很大的地方
(10)柱子不用或贮藏时，应封闭并贮存在惰性溶剂中
☆ 柱子的清洗
1．柱子的清洗
即使样品和流动相已做过前处理，也仍难以完全避免柱子受到污染，因此必须对柱子行清洗。清洗应定期进行，如果在短期内分析许多样品，则以每日清洗一次为宜，至少也应一周一次，防止有太多的杂质在柱上堆积。
反相柱的常规洗涤办法是：分别取甲醇、三氯甲烷、水、甲醇各20倍柱体积（即对于一根4.6mm×25cm的柱来说，通常是50—60ml，而对于9.4mm×50cm的柱来说，通常是500--600m1），使之通过柱子。然后用流动相平衡（通常仍用20倍柱体积），柱一般将恢复正常。如果选择性仍和以前不一样，则表明还有其他杂质留在柱子里，这时应考虑更加严格的清洗：先用20倍柱体积的水，再用相同体积的0.05mol/L硫酸，最后用流动相溶剂、酸洗常能洗下有机溶剂所不能洗下的剩余杂质；在低pH值下做长期清洗是不适宜的，但50ml洗液以2ml/min的速度清洗25min，一般对键合相没有损害。注意，强碱不能用来清洗任何微粒硅胶柱(不论是键合相还是非键合相)，因为硅胶骨架会溶解。对于严重污染的反相柱只能采用再生的方法。
2．柱头孔隙的处理
拆下不锈钢烧结过滤器后，检查柱床，常可见柱头塌陷，此时先剔掉无规则床层和带色填料，使柱床呈白色并完全水平，再用甲醇作糊状填料匀浆液，将填料匀浆液滴在柱上靠重力从匀浆液中排出甲醇液，重复数次，直到水平，完成了柱的再生。此时，如果柱头孔隙深度小于1cm，可以采用下述局部重装的办法，否则，柱应当完全重装或更换。
柱入口局部重装时采用的填料可以和原填料一样，也可用玻璃珠。粒径大于20um的可用敲打充填法干装。如果粒径小于20um则要用合适的溶剂配成匀浆，匀浆逐次加入，每次加入前都要使上一次加入的全部沉降。把孔隙填满后，用刮刀将填料刮平，更换柱入口接头，把柱重新接到液相仪器上，慢慢地增加流动相流速和系统压力，直到操作上限为止。让相当于10—20倍柱体积的流动相通过柱子，然后逐渐降低流速，并使压力降为零，再把柱子卸下来，并卸下入口接头，观察柱的入口。此时孔隙应当减小，但是由于新加入的填料在系统的操作压力下压入柱头，孔隙不可能一次就被全部充满。重复上述重装过程，直到柱上加不进更多的填料为止。一旦柱子填充完毕，可加进混合样品，测定柱子的性能是否已经改善。
☆ 色谱柱的再生
高效液相柱是消耗品，会随使用时间或进样的次数增加，出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰，柱效下降。需要定期进行彻底清洗和再生。
1.反相柱
分别用甲醇：水＝90：10、纯甲醇、二氯甲烷等溶剂着流动相，依次冲洗，每种流动相流经色谱柱不少于20倍的色谱柱体积。然后再以相反的次序冲洗。
2.正相柱
分别用正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇等溶剂做流动相，顺次冲洗，每种流动相流经色谱柱不少于20倍的柱体积（异丙醇粘度大，可降低流速，避免压力过高）。注意使用溶剂的次序不要颠倒，用甲醇冲洗完后，再以相反的次序冲洗至正己烷。所有的流动相必须严格脱水。
3.离子交换柱
长时间在缓冲溶液中使用和进样，将导致色谱柱离子交换能力下降，。用稀酸缓冲溶液冲洗可以使阳离子柱再生，反之，用稀碱缓冲溶液冲洗可以使阴离子柱再生。
用户还可以选择能溶解柱内污染物的溶剂为流动相做正方向和反方向冲洗。但再生后的色谱柱柱效是不可能恢复到新柱的水平的。
注意：如果柱子装反了，可以调回来，但可能会造成柱内担体塌陷。在不得已的情况下尽量不要反装色谱柱。在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能成铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。
如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。
☆ 色谱柱的平衡
每天用足够的时间来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！------ 一定得做！
新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且，在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。
平衡色谱柱
反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉，因此在用流动相分析样品之前，应使用10－20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱；如果您所使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"。
硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相，请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡.平衡过程中，将流速缓慢地提高。
用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较长的时间来平衡）
1.使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）
2.大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围
3.避免流动相组成及极性的剧烈变化
4.流动相使用前必须经脱气和过滤处理
5.如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存大乙腈中
6.压力升高是需要更换预柱的信号
☆ 反相系统换正相系统注意事项
在液相色谱仪使用过程中，我们经常遇到液相色谱仪用户正反相色谱系统互相现象，但由于使用操作不当，常常不注意间损坏了色谱柱，同时加重了液相色谱系统的污染，导致分析工作出现麻烦，现在将置换工作的基本流程列出，供用户参考：
1.首先用甲醇(或已睛)将色谱系统包括反相柱平衡好(保证20分钟内基线平直,无峰出现)；2.卸掉反相柱，封好保存；
3.将进样阀与检测器短路,用异丙醇冲洗色谱系统10分钟(流速1ml/min)，在这期间空拨进样阀三次；
4.换正己烷(硅胶柱)冲洗系统20分钟(流速2ml/min)，此期间空拨进样阀三次；
5.安上硅胶色谱柱， 流速调到1ml/min,用正己烷冲洗系统，直到系统平衡；
6.进三针标准品检验面积、保留时间是否重复,若不重复,继续冲洗直到重复
☆ 正相系统换反相系统注意事项
在液相色谱仪使用过程中，我们经常遇到液相色谱仪用户正反相色谱系统互相现象，但由于使用操作不当，常常不注意间损坏了色谱柱，同时加重了液相色谱系统的污染，导致分析工作出现麻烦，现在将置换工作的基本流程列出，供用户参考：
1.首先用正己烷(硅胶柱)将色谱系统包括正相柱平衡好(保证20分钟内基线平直,无峰出现)；
2.卸掉硅胶柱，封好保存；
3.将进样阀与检测器短路，用异丙醇冲洗色谱系统10分钟(流速1ml/min).在这期间空拨进样阀三次；
4.换甲醇(或已睛)冲洗系统20分钟(流速2ml/min) ，此期间空拨进样阀三次；
5.安上反相色谱柱， 流速调到1ml/min,用甲醇(或已睛)冲洗系统，直到系统平衡；
6.进三针标准品,检验面积 ﹑保留时间是否重复,若不重复,继续冲洗直到重复。
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