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【求助】beta-actin条带清楚，却没有目的条带
请问beta-actin有条带，却没有目的条带是哪些方面所致？【求助】beta-actin条带清楚，却没有目的条带
我的实验步骤如下：
1.提取组织总蛋白的裂解液如下：
单去污剂裂解液（50mmol/L Tris•HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100ug/ml PMSF）：
1mol/L Tris•HCl（pH8.0） 2.5ml
NaCl 0.438g
TritonX－100 0.5ml
蒸馏水至 50ml
混匀后， 4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100ug/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。
2.40％Acr/Bic,积层胶（60v）是5％，分离胶（90v）是12％.分子量是53，35，17kDa
3.转膜(250mA恒流)
分子量是57:1h和2h都做过
分子量是17：转膜50分钟
4.一抗37度两小时，二抗37度一小时，都是TBST洗三次，各5－10分钟
（注：师兄师姐用过的抗体，时间最少一年）
5.显色后，分子量57kDa,35kDa，17kDa都没条带（一点迹象都没有）。只有beta-actin有条带。
什么原因呢？
1.样品提取？样品中有内参，是不是一定就有目的蛋白呢？
2.还是抗体？二抗应该没问题吧？
急盼！
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最新回复
jingling845 (2014-2-22 21:43:55)
1 你的目的蛋白在组织中的表达量，如果本身就表达很低，就可能检测不出来。
2 既然你内参作出来了，说明样品提取中出现的问题不大，但也不能完全排除目的蛋白降解的可能。转膜充分很关键，你最好用丽春红染色看看目的蛋白有没有充分转到膜上。
3 封闭一定要充分，也是比不可少的。
4 如过以上都没问题，应该就是抗体的问题了，如果你用的抗体原来就稀释好的，效价肯定会降低，最好加大抗体浓度。
mogu (2014-2-22 21:44:12)
多谢指点！
1.样品提取没什么问题我就放心啦
2.染胶（没加marker）后看到好多条带,但不知道是否是我需要的。
3.转膜不管用多长时间，感觉胶上的蛋白都差不多，大部分都转过去了，显色后却没条带
4.抗体是我最近稀释的，按说明书取中间值
lixi559 (2014-2-22 21:44:30)
1.内参可以做出来并不代表标本没问题，因为内参的表达量很大，就算标本降解了，用ECL这种灵敏度高的检测方法还是可以轻松做出来。我就试过标本煮沸变性后，在常温下放了两周，然后做WB，仍可以做出来内参，不过随标本降解，条带略模糊。但目的条带基本就看不到了。
2.转膜条件：从你的实验结果看，分子量最小的没做出来，很有可能是恒流转膜电压过高，转的过了头，建议调整为恒压45v，低温转80min，此条件我做出过15k的。
3.抗体孵育，国外的抗体多建议4摄氏度摇床过夜，你孵育时间可以试着延长下。
kewanqi2011 (2014-2-22 21:44:49)
mogu (2014-2-22 21:45:19)
首先非常感谢各位!
1.请问有人用过我提取组织的裂解液吗?在网上查的不知如何
2.测蛋白浓度:Bradford
样品(3ul)+生理盐水(57ul)＋G-250(3ml),测得浓度再乘以稀释倍数20，即为每微升的浓度:12ug/ul 上样量为80ug
不知上述方法对吗？
样品：2*上缓＝1：1（各样品用蒸馏水配成等体积），
3.我是所有的目的蛋白都没出来.恒流（250mA）时电压是100v
4.今天做的western电泳同前：60v.90v,两小时就跑完啦，是不是太快啦
请问你的转膜是半干转吗
mogu (2014-2-22 21:46:24)
1.上样缓冲液室温下保存多久？过期会对什么有影响？
2.丽春红染色结束必须用水洗掉？与蛋白怎么结合的？还有颜色的话会影响抗体的结合吗？
3.封闭后用水洗3次×5分钟可以吗
多谢
mogu (2014-2-22 21:46:41)
请教各位：
1.怎么检测样品有没目的条带
2.怎么检测一抗有没问题，做阳性对照吗？怎么做？
ha111 (2014-2-22 21:48:37)
跟我刚开始做WB的情况一样。我的目的蛋白是：57KD和30KD
可能的问题：
1.蛋白提取和保存：对于提组织蛋白来说，个人感觉单去污对蛋白酶抑制的强度不够，我另外还加了两种蛋白酶抑制剂；即使如此，有的样品冻融过一次就出现过降解的情况。所以建议提蛋白时，加酶抑制剂（Roche有片剂，溶解了可以直接用的，我们实验室就用的这种，可惜我没用上）；并且分装最好保存在-70，天气热，-20冰箱不是你一个人用，有的人打开了好久也不关，你的样品就遭殃了。
2.上样量的问题：似乎很多人都忽略了。如果目的表达丰度低，所提样品的浓度又不高的话，一般的50微克是做不出来的。我的57KD蛋白，就需要上150微克才做出来很细的条带。
3.转膜的过程：这个过程最需要耐心。针对你实验室的现有条件，优化转膜条件。我57KD用的是恒压100V，转1h40min，0.2微米的PVDF膜。还有就是膜也很重要，刚开始我用的是NC膜做30KD的，转膜条件变了好多都做不出，换了膜就OK了，现在上10微克也很强的条带。
4.一抗的问题：时间久了效价会下降这是肯定的，关键在于下降了效价是不是在提高了一抗浓度能得到补偿。要证实这个问题，你需要做阳性对照，即找一种肯定表达目的蛋白的组织或细胞，用这个一抗做一次就明了了。但是提高一抗浓度势必会增加背景，有时候不得以而为之，先做出目的再调整条件。
5.二抗的问题：你的目的和内参用的是同样的二抗吗？如果不是还需要排除二抗的问题，这个简单些，问别人要一点同样的二抗做一次就可以了，就用同一张膜！
6.发光液：如果你的内参发光速度比较慢，还要怀疑发光液是否不好了。我就遇到这个情况。如果你已经排除了以上我所说的1-5点情况，可以试试增强型发光液，就是贵一点，但确实发得很快，比较省一抗。
如果还有别的问题，请其他的战友补充！
uuooii (2014-2-22 21:49:56)
可能的问题：
1.蛋白提取和保存：对于提组织蛋白来说，个人感觉单去污对蛋白酶抑制的强度不够，我另外还加了两种蛋白酶抑制剂；即使如此，有的样品冻融过一次就出现过降解的情况。所以建议提蛋白时，加酶抑制剂（Roche有片剂，溶解了可以直接用的，我们实验室就用的这种，可惜我没用上）；并且分装最好保存在-70，天气热，-20冰箱不是你一个人用，有的人打开了好久也不关，你的样品就遭殃了。
2.上样量的问题：似乎很多人都忽略了。如果目的表达丰度低，所提样品的浓度又不高的话，一般的50微克是做不出来的。我的57KD蛋白，就需要上150微克才做出来很细的条带。
3.转膜的过程：这个过程最需要耐心。针对你实验室的现有条件，优化转膜条件。我57KD用的是恒压100V，转1h40min，0.2微米的PVDF膜。还有就是膜也很重要，刚开始我用的是NC膜做30KD的，转膜条件变了好多都做不出，换了膜就OK了，现在上10微克也很强的条带。
4.一抗的问题：时间久了效价会下降这是肯定的，关键在于下降了效价是不是在提高了一抗浓度能得到补偿。要证实这个问题，你需要做阳性对照，即找一种肯定表达目的蛋白的组织或细胞，用这个一抗做一次就明了了。但是提高一抗浓度势必会增加背景，有时候不得以而为之，先做出目的再调整条件。
5.二抗的问题：你的目的和内参用的是同样的二抗吗？如果不是还需要排除二抗的问题，这个简单些，问别人要一点同样的二抗做一次就可以了，就用同一张膜！
6.发光液：如果你的内参发光速度比较慢，还要怀疑发光液是否不好了。我就遇到这个情况。如果你已经排除了以上我所说的1-5点情况，可以试试增强型发光液，就是贵一点，但确实发得很快，比较省一抗。
如果还有别的问题，请其他的战友补充！
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太谢谢你了！
1.肾脏组织是去年取的，今年三月提的蛋白，可能是时间长的问题，也可能是裂解液的问题。我也考虑换成三去污裂解液提取蛋白。
2.我刚做了一次上样量是180ug，膜上只有大分子量，但不是很清楚（250mA,50分钟）。小分子量是一片，但是冻融过一次（前一天测得浓度），降解有这么快吗？转膜是转过了，但也不会这样吧，一点都没有。
3.膜是0.2um的硝酸纤维素膜应该还可以
4.是同一个二抗
5.TMB显色：内参5分钟即可
现在估计样品和一抗的问题。
nn255 (2014-2-22 21:50:33)
1.目的蛋白在正常动物肾脏组织有表达否，如果有表达，那你可以用一只正常动物肾脏重新抽提蛋白，蛋白浓度可以不测，根据你上次取的组织量大概估算一下，后将新抽提的样品及原来抽提的样品一起上样，接着就按照你原来的条件重新检测一下目的条带，看看两样品出现的条带是否有区别，不一致则样品降解；一致，则可以排除样品的问题。若是正常动物中目的蛋白没有表达，或是诱导型表达，那你就得取模型动物的组织了，这样就有点麻烦了，期望不是后者了，祝你好运！
bluelake (2014-2-22 21:51:08)
一般我们实验室采用0.45微米的膜,但是对待这种分子量小的蛋白质,我们会用孔径更小的膜,否则你的目的蛋白可能会透过膜,而不是结合在膜上,建议采用0.2微米的PVDF或硝酸纤维素膜.
zzzz (2014-2-22 21:51:54)
2.你用的是湿转还是干转？我估计是半干的吧，电流这么大啊！我没有用过，你的膜一般多大？
3.目的蛋白是糖蛋白或是其他比较特殊的，建议最好换用0.2的PVDF膜，其吸附性更好，不容易透。
4.测浓度的蛋白和上样蛋白分开装，就不存在冻融的问题了，天气热，动作慢、酶抑制剂不好的话，还是有降解的可能！顺便问一句，你用什么方法测浓度？BCA？
5.电泳的时候，Maker的条带好吗？如果想看看电泳的结果，可以尝试染胶。想判断转膜的效果，可以染膜，但孵一抗前要把膜洗干净。
6.化学发光法比***或DAB显色更敏感！
再换换试试！
mogu (2014-2-22 21:52:29)
1.目的蛋白在正常动物肾脏组织有表达否，如果有表达，那你可以用一只正常动物肾脏重新抽提蛋白，蛋白浓度可以不测，根据你上次取的组织量大概估算一下，后将新抽提的样品及原来抽提的样品一起上样，接着就按照你原来的条件重新检测一下目的条带，看看两样品出现的条带是否有区别，不一致则样品降解；一致，则可以排除样品的问题。若是正常动物中目的蛋白没有表达，或是诱导型表达，那你就得取模型动物的组织了，这样就有点麻烦了，期望不是后者了，祝你好运！
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谢谢！
我准备用新样品做一次（我做的是急性模型，也容易做），用原裂解液和三去污裂解液所提取的组织一起上样，再没条带的话，就是一抗的问题了。
mogu (2014-2-22 21:53:05)
一般我们实验室采用0.45微米的膜,但是对待这种分子量小的蛋白质,我们会用孔径更小的膜,否则你的目的蛋白可能会透过膜,而不是结合在膜上,建议采用0.2微米的PVDF或硝酸纤维素膜.
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我用的是0.2um硝酸纤维素膜。谢谢！
mogu (2014-2-22 21:53:26)
2.你用的是湿转还是干转？我估计是半干的吧，电流这么大啊！我没有用过，你的膜一般多大？
3.目的蛋白是糖蛋白或是其他比较特殊的，建议最好换用0.2的PVDF膜，其吸附性更好，不容易透。
4.测浓度的蛋白和上样蛋白分开装，就不存在冻融的问题了，天气热，动作慢、酶抑制剂不好的话，还是有降解的可能！顺便问一句，你用什么方法测浓度？BCA？
5.电泳的时候，Maker的条带好吗？如果想看看电泳的结果，可以尝试染胶。想判断转膜的效果，可以染膜，但孵一抗前要把膜洗干净。
6.化学发光法比***或DAB显色更敏感！
再换换试试！
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谢谢！
1.组织放在液氮，好像放－70度也可以吧，我昨天取的组织放在－70
2.转膜仪是六一厂的DYY-11型，是半干转。膜大小是（7－8）cm×（4－5）cm
3.目的蛋白是caspase,Nc 还行吧
4.本以为反复冻融影响不会很大。主要是酶抑制剂只加了PMSF，是不是还得加其它的？测浓度是用Bradeford
5.电泳时Marker小分子条带不清楚，有点模糊，保存时间长好像有这种现象。
一抗前洗膜？用什么洗，水还是TBST？一抗也可以用封闭液稀释啊与一抗前的封闭没什么冲突吧？
birdfish (2014-2-22 21:54:09)
1.组织保存在-70可以。
2.膜最大也就是40cm2，那你的电流也太大了吧，我们按膜大小*0.65，转2h，或者*1.3，转1h。
3.这个蛋白没做过，不知道NC是否可以，但还是建议你用PVDF膜试试。说不定有意想不到的结果。
4.反复冻融肯定是有影响的，我做同一个蛋白，摸索条件时用的同一个管，做几次蛋白就不行了，一抗、二抗浓度是一样的。
5.如果你用丽春红染了膜，就要洗干净，刚开始可以用双蒸漂两遍，再用封闭液洗，可以洗得很干净。一抗必须用封闭液稀释，并且是现配现用。
6.是我孤陋寡闻了。不好意思！
mogu (2014-2-22 21:54:39)
QUOTE:
1.转膜也许与仪器有关，不清楚，是同科室的建议我用这么大电流，我也看到好多是1－1.5mA/cm2，我再用新样品试试，不行的话就换电流2.NC刚买的，先看看再说
3.丽春红染膜后洗不干净会影响结果吗，是不是一抗结合不上去？封闭后膜干净就行吧？
4.另外，请问准备测肌酐，大鼠血浆怎么处理，需要离心吗？还是直接凝固后的血清即可
5.知道提取组织总蛋白和胞浆蛋白的提取试剂及步骤吗？
谢谢！
birdfish (2014-2-22 21:55:07)
QUOTE:
1.转膜和仪器的关系很大，所以要因地制宜。2.我也是刚买的NC膜，做不出来，果断地换了PVDF膜，效果超好。用NC膜，上样量160微克也没做出（半干转），用PVDF膜，上样量10微克，条带都很粗（湿转）。当然还有其他方面的差异了。
3.丽春红可能会影响抗原和抗体的结合所以要洗干净。我有同学用封闭液将膜洗干净了后照样可以发的很漂亮。
4.血浆蛋白我没有做过，没有经验。请向其他战友请教。
5.组织蛋白和胞浆蛋白的提取试剂是一样的。
mogu (2014-2-22 21:55:30)
QUOTE:
谢谢关注！这两天又在取组织，过两天看看新组织的情况
mogu (2014-2-22 21:56:10)
大家好！又有问题得请教了
1.我用新提取的蛋白跑电泳后染胶，看到条带都集中在胶的上半部，挺密的，感觉是没抛开。与什么有关呢？
（1）.胶：分离胶是12％，积层胶是5％
（2）.上样量:体积是35ul
2.跑电泳时溴酚蓝不是一条线，有点分散，差不多一厘米的宽度。是什么问题呢
谢谢
【求助】beta-actin条带清楚，却没有目的条带