【转帖】【分享帖】我国抗体产业、抗体产业关键技术综述

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• 轰轰 (2015-2-25 19:04:40)

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  抗体作为机体免疫应答的效应分子，能够识别、中和或清除诱发疾病的抗原。抗体的“可变区”（Fab）可特异性的结合抗原或靶细胞；抗体的“恒定区”（Fc）介导多种细胞效应功能（CDC、ADCC等）。此外，Fc端与FcRn的结合，使得抗体分子在体内的半衰期长达十至二十天。以上抗体的分子结构与生物功能保证了其作为治疗性蛋的药用疗效。
  截止2012年底，欧美市场已有总计三十余种治疗性抗体上市销售（见图1）。以上抗体药物已经在免疫性疾病[1]、癌症[2]等治疗领域取得巨大成功。而从抗体药物的研发线来看，已经有三百余种单抗药物进入临床研究阶段[3]。抗体药物研制的成功率（20%）远远高于传统小分子化学药（11%）[4]。所以，抗体药物已经成为，并且未来仍将是制药行业发展的主要方向[5]。
  1 抗体技术与抗体药物的发展进程
  1.1 抗体技术的发展进程
  抗体在临床上的治疗性应用，始于1888年Emile Roux使用“多克隆抗体”治愈白喉病患者。1897年Paul Ehrlich's 提出了“魔术子弹”（magic bullet）的假说：即利用抗体进行“靶向治疗”。利用抗原免疫动物可以快速获得含有多克隆抗体的“抗血清”。但是由于多克隆抗体本质上是针对抗原不同表位的单克隆抗体混合物，其质量并不均一，加之受免疫动物的制备路线所限，多克隆抗体在临床上的应用并不多见；上世纪七十年代，利用小鼠B淋巴杂交瘤细胞，可以获得抗单个抗原决定簇的“单克隆抗体”，后者较多克隆抗体特异性高、均一性好，成本低廉，为抗体技术的临床应用带来突破[6]。
  上世纪八十年代，美国Gentech公司申请了关于“重组抗体”制备的首个专利（“Cabilly patent”专利），即利用DNA重组技术，将抗体重链、轻链DNA同时导入宿主细胞，后者合成并分泌具有生物活性的单克隆抗体。此后，治疗性抗体的生产真正进入到产业化阶段。另外，基因工程抗体能够在基因水平对抗体分子进行切割、拼接，组装，赋予抗体分子新的生物活性，较“多克隆抗体”“杂交瘤单抗”更具应用前景。
  1.2抗体药物的发展进程
  1986年，采用杂交瘤技术生产的“鼠源单抗”OKT3TM（muromonab）成为上市的首个治疗性单抗。但是，由于鼠源单抗严重的免疫原性（人抗鼠抗）问题。抗体药物在上市的首个十年间临床应用并不广泛。 此后，“嵌合抗体”技术保留鼠源Fab，采用人源Fc段替代鼠源Fc端，部分减轻了鼠源抗体的免疫原性。“CDR移植技术”又可将可变区的部分序列更换为人源序列，进一步的减轻嵌合抗体的免疫原性，采用此技术的抗体药物称之为“人源化抗体”（humanized antibody）。由于成功的降低了重组抗体的免疫原性，上世纪九十年代末上市的诸多嵌合抗体和人源化抗体，得以在临床上广泛应用。
  “嵌合抗体”的人源程度可达66%，“人源化抗体”可达90-95%，但仍不是真正意义上的“人源抗体”。上世纪八十年代发展起来的“体外展示技术”（噬菌体、酵母菌、核糖体展示等），通过构建大容量人源抗体文库，可实现全人源抗体的体外筛选[7]（如2002年上市Adalimumab）。本世纪初兴起的的“转基因鼠”技术（如：HuMAb-MouseTM、KM-MouseTM、XenoMouseTM、VelocImmuneTM、等），在小鼠体内转入了人的抗体基因簇，经抗原免疫后也产生全人源抗体[8]（如2006年上市的Panitumumab）。此外，近年来出现“兔单抗”技术（如RabMAbTM），较传统鼠源抗体亲和力强、特异性高，也是成为抗体药物设计的一种选择[9]。从目前以上市抗体的结构分析，人源化抗体及全人源抗体已经成为抗体药物的主流[10]（见图1）。
  目前抗体药物开发的最新趋势体现在：一是，在原有药物靶点基础上，利用“抗体工程”技术，提高单抗药物的疗效[11]（见图2）；二是，构建抗体免疫连接物、抗体片段、双特性抗体，或新型结构的抗体药物。如：2007年上市的Soliris?（Eculizumab），其Fc端为IG2/4的嵌合体[12]；2009年上市的“三特异性抗体”RemovabTM，可变区可同时结合肿瘤靶点和CD30受体。[1]

• 轰轰 (2015-2-25 19:04:59)

  
  2 国内外抗体药物产业现状
  2.1 国际上抗体产业现状
  2009年美国市场上的抗体药物成为生物技术药物销售额最大的类别。此后数年，抗体药物的销售额均保持在6-8%的增长率。2010年美国市场的单抗药物销售额为185亿美元，世界范围内单抗药物销售额总计已达400多亿美元，约是整个生物制药市场份额的36%[13]。在已上市的单抗药物中，销售额排名前五位的单抗品种，为整个抗体药物市场贡献着82%的市场份额。因此，抗体药物的品种上有所谓“Big 5”之说（即： bevacizumab、trastuzumab 、adalimumab、 infliximab，rituximab）。据预测，2014年adalimumab和bevacizumab将成为世界上销售量最大的药物品种[14]。
  在国际制药行业，一方面，传统制药公司通过兼并建立其在抗体药物上的产品线，如：强生收购Centocor，罗氏收购Immunex、Genentech等；另一方面大型药企通过组建自己的抗体药物研发平台，以保持其在单抗药物开发上的技术优势。如Seattle Genetics重点发展“抗体免疫连接物”，[15]。GSK和Boehringer Ingelheim通过并购，建立“双特异性抗体”药物研发平台[16]。
  随着抗体原研药物相关专利的到期，欧盟、美国开始考虑审批抗体仿制药。2010年11 月，EMEA也出台了《生物仿制药的草案》，2012年2月FDA也颁布了《生物仿制药指导原则草案》，两者均开始建立以“生物相似度”为核心的生物仿制药审批流程，这些都为抗体仿制药的审批铺平道路。而在政策相对宽松的亚洲，我国、印度、韩国均已有抗体仿制药上市。印度Dr.Reddy公司的RedituxTM售价仅为原研药物RituxanTM成本的十分之一[17]。我国市场上也出现仿制药益赛普TM、强克TM与原研药物EnbrelTM竞争的局面。
  2.2 我国抗体产业发展现状
  我国的抗体药物产业尚处起步阶段，近十年间国内先后涌现出后中信国健、百泰生物、成都弘康、上海赛金等多家专门从事单抗药物生产的企业。同时，许多传统制药企业（哈药、海正、华药、先声等）也开始涉足抗体药物领域。特别是近两年，服务抗体药物开发的CRO/CMO公司（药明康德、义翘神州、中美奥达等）开始出现。标志着新兴的抗体产业在我国已初现雏形。
  但是，无论从上市品种，还是从行业产能，技术水平等方面分析，我国的抗体产业的发展尚处于起步阶段。目前我国的上市抗体品种中（见表一），国外进口单抗占据多数，我国市场上唯一全人源抗体（Adalimumab）为国外公司（Abbott）进口，上述“Big 5”单抗药物在国内均已上市；我国自主研发的六种抗体药物，以鼠源、嵌合、人源化为主，多集中在少数靶点上（TNF、EGFR，CD25等）。这就意味着相同临床适应症上，将面临国内外不同厂家的品种竞争。

• 轰轰 (2015-2-25 19:05:16)

  更为重要的是，治疗性抗体作为大剂量重组蛋白药物。一个年销售额过亿美元的单抗药物，往往需要年产百公斤级重组蛋白的产能做支撑。行业的技术水平与产能规模将直接影响上市抗体的成本与盈利。我国抗体行业普遍存在着细胞系表达水平低，培养规模小、纯化能力不够等技术问题[18][19, 20]。以上诸多“产业化关键技术”限制了我国抗体产业的产能规模，制约了行业的发展进程（见图2）。
  3 抗体产业关键技术
  目前国际上抗体药物的生产成本一般控制在500美元/g以下。为此，相应的产业化技术水平要达到以下指标：细胞系表达能力>20pcd（pg/cell/day），大规模培养工艺抗体表达水平在1-5g/L，下游纯化能力在50~100kg/batch，纯化收率在70%以上[21][22]。
  3.1工程细胞系的构建
  能够正确表达重组抗体的细胞系，还需具备“生长能力强，表达水平高、遗传稳定性等”特性，才能成为具有产业化价值的“工程细胞系”[23]。国内目前抗体表达水平普遍偏低（<1g/L），其根本原因在于细胞系生产能力的不足（＜20pcd）。
  在宿主细胞的选择上，除了少数“鼠源抗体”仍由骨髓瘤细胞（NS0、sp2/0）生产外，绝大多数抗体药物均由CHO细胞生产。近年来，Crucell公司开发的人视网膜细胞系PER.C6 TM，借助病毒载体能够实现重组抗体的高表达；Merck公司开发的酵母GlycoFi TM，具备了抗体的特异性糖基化修饰能力[23]。
  宿主细胞的遗传改造主要集中在借助于“细胞工程”技术提高细胞的生长能力和表达水平。如：通过导入抗凋亡蛋白基因（bcl-2、bcl-xl），使宿主细胞具有更强的生长能力[24]；通过构建“自分泌细胞”表达生长因子，使宿主细胞更适合无血清培养；通过过度表达二硫键异构酶及相关分子伴侣（Bip/GRP78，ERp57），提高宿主细胞对异源蛋白的折叠、分泌能力，等等。[25]
  业内在细胞构建中多使用的“基因共扩增体系”（如：DHFR/CHO DG44，GS/CHOK1），在基于此原理的重组细胞筛选过程中，易出现目的基因拷贝丢失、克隆间差异性差等问题，为此可采用了“弱化筛选基因”、“双筛选基因” [26][27]等多种改良策略。此外，已经出现多种商品化载体功能元件，能够克服载体“随机整合”时的“位置效应”，如：强迫目的基因表达的侧翼元件STARTM、UCOEsTM、MARsTM等；用于目的基因“定点整合”的Flp‐InTM技术，以及源自逆转录病毒的新型载体GPExTM等[28, 29]。
  在“克隆筛选”环节，传统的“有限稀释法”正在被流式细胞仪自动分选或高通量筛选设备（如clonePixTM，CellCelectorTM，CelloTM）所代替[30]。此外，工程细胞系的筛选策略，也由单一以表达水平为依据，也开始转向综合评价细胞的生长能力[31][32]、生产能力、产物质量[33]等多方面因素。

• 轰轰 (2015-2-25 19:05:38)

  
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  3.2细胞大规模培养工艺开发
  目前，国际上重组抗体的制备主要采用动物细胞培养工艺，其容积产率一般可达3-5g/L [27]（最高可达13g/L[34]）。大型制药企业的培养规模超过二十万升（如：Amgen公司 200,000L，Genentech 公司250,000L等）[21]，国内重组抗体生产水平低于1g/L，流加培养规模不超过3,000L（中信国健），灌注培养规模不超过（500L）[18, 19]。
  动物细胞用培养基逐渐由“无血清培养基”或“无动物来源培养基”转向“化学明确培养基” [35]。在培养基优化策略上，除了传统的“组分滴定”、“培养基混合”、“消耗成分分析”，“化学计量法”外[36]，目前更多的倾向于综合上述方法优点的“理性培养基优化[37]”和“系统培养优化” [38]。此外，借助迷你反应器（BioLectorTM、SimCellTM、Micro-24TM,ambrTM等），可实现高通量实验设计[39]。
  流加培养模式是目前重组抗体生产的主流方式，其配套反应器多为搅拌罐和气升罐。近年来兴起的一次性反应器（waveTM、Hyclone S.U.BTM等）多用于扩增种子细胞或制备小规模样品。流加培养存在营养物质消耗、代谢废物积累，以及产品质量不稳定等问题，因此其工艺优化集中在基础培养基、流加培养基以及流加策略上[40][41][42]。
  灌注培养模式下，细胞密度、蛋白产量可较流加模式提高数倍[43, 44]。但是该工艺需使用细胞截留需特殊装置（如旋转滤器、倾斜沉降装置、超声截留装置等）[45]，这就限制了其工艺的可操作性和放大性。灌注培养工艺的优化策略为通过优化培养基组分，降低灌流速度，提高产物容积收率[46]。
  细胞培养工艺中的物理条件（温度、pH、渗透压等）、营养成分等均会重组抗体的质量（聚体[47]、糖基化[48]，电荷变异等[49][50]）影响。因此，建立用于上市抗体生产的细胞培养工艺，需要事先对其进行充分的“定性研究”，以确定各工艺参数的控制范围[51][52]。

• 轰轰 (2015-2-25 19:05:56)

  
  3.3大剂量重组蛋白纯化、质控
  随着产业上游培养规模（>10，000L）、抗体产率（>5g/L）的提高。下游纯化纯化环节的处理能力成为限制产能的“瓶颈”。另外，纯化环节介质的成本占据抗体药物的生产成本的70%以上。规模、成本上的压力使得业内普遍认为：未来下游纯化将是制约抗体行业扩大产能的主要因素[53]。
  目前，业内普遍采用一条抗体纯化生产线，与数个发酵罐配套的设计方案。细胞收液通常采用微滤、离心、深层过滤等方法实现“固液分离”，通过“亲和色谱”（protein A，protein G）捕获抗体。然后再使用“精制色谱”（阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、疏水色谱等）进一步去除宿主蛋白、宿主DNA、色谱配基等杂质。此外，FDA要求整个纯化过程中需配有至少两步病毒灭活步骤。[54]
  目前使用的亲和色谱（Prosep vATM、MabSelectTM、MabCaptureTM），其抗体捕获能力通常在15~50g/L。由于“柱色谱”不能无限制放大，其产能放大存在限制。新兴的一次性“膜色谱”技术，如Q膜色谱技术（如SingSep Q TM）处理能力可达10~36kg/L [55]，具有潜在的应用价值。
  抗体分子在整个制备工艺中存在多种降解途径，如：裂解、二硫键错配、甲硫氨酸氧化、谷氨酸焦谷氨酸化、天冬酰胺脱乙酰化、天冬氨酸异构化等，上述降解途径会导致重组抗体在分子量、纯度、等电点、糖基化等方面出现“异质性”，并最终影响抗体药物的临床疗效[56]。因此，抗体药物的质控需根据临床疗效确定其关键质量属性（Critical quality attribute），并据此确定抗体药物的工艺过程、质量标准。
  四 结语
  我国于2011年已经成为世界第三大医药市场。国内对于抗体药物的市场需求巨大。生物制药产业也因此被列为我国十二五期间的战略性新兴产业。基于抗体抗体的生物制药产业将是未来国家培育的重点行业。近年来，国家先后建立“抗体药物国家工程中心”（上海）、“抗体药物研制国家重点实验室”（石家庄）等国家级重点实验室，行业内部业内也自发形成“抗体产业联盟”等组织。市场需求的驱动、产业政策的扶持，都为我国抗体产业发展提供了良好的机遇。一旦在上述产业关键技术上取得突破，我国的抗体产业必将十年之内有一个跨跃式的发展！

• 轰轰 (2015-2-25 19:06:17)

  用于重组抗体生产的细胞构建技术研究进展*

  
  近年，随着宿主细胞遗传特性的改造，载体功能元件的优化，以及高通量克隆筛选技术的发展，国际上用于抗体生产的工程细胞系表达水平可达20~70 PCD(pg/cell/day)。业内完成稳定细胞系的构建时间也缩短至3~6个月&#91;1]。生产细胞系的构建是重组抗体产业化制备的第一步。作为抗体产业上游关键技术，如何快速、高效建立生产细胞系，是我国抗体产业发展中急需解决的技术瓶颈[2]。
  1 用于抗体生产的工程细胞系构建流程
  抗体分子具备四聚体糖蛋白的复杂分子结构，其胞外表达又遵循着“分泌蛋白”的一般规律：全抗体分子的轻、重链各自翻译后，经折叠、组装，糖基化修饰后才具生物活性。已上市抗体的临床研究也表明，宿主细胞对重组抗体的“翻译后修饰”，直接影响到抗体药物的临床疗效和免疫原性[3][4]。
  在常用的异源蛋白表达系统中：大肠杆菌不适合全抗体分子，只能表达单链抗体或者抗体片段；酵母细胞、昆虫细胞、转基因植物等由于缺乏翻译后修饰能力，其所表达的重组抗体与人天然抗体存在着显著的质量差异。只有哺乳动物细胞适宜重组抗体的异源表达。因此，目前已上市的治疗性抗体中，除了少数抗体片段（如：LucentisTM）外，均由哺乳动物细胞生产[5, 6]。

• 轰轰 (2015-2-25 19:06:59)

  
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  1.1 用于抗体药物生产的宿主细胞
  
  哺乳动物细胞中，CHO、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞、PerC.6、HEK293等均有用于重组抗体生产的实例（见表1）[6]，这其中CHO、NS0及sp2/0细胞由于具备相对成熟“平台化开发技术”应用较为广泛。上述动物细胞由于其生长、代谢特性的不同，对重组抗体的表达、修饰能力也不尽相同。CHO、NS0,sp2/0均可产生非人源的糖基化修饰。如：sp2/0生产的Cetuximab因含非人源“α(1,3)半乳糖结构”造成临床上出现过敏反应[7]等。
  1.2“工程细胞”的概念与构建流程
  用于抗体药物生产的工程细胞系需具备以下特性：生长特性良好，无血清悬浮培养密度高（1~2×107cell/ml）；异源蛋白表达能力强（20~70 PCD），具备正确的翻译后修饰能力；宿主及重组细胞系遗传背景清晰、表型稳定，符合相关法规要求。
  目前，业内细胞系构建中常用的筛选体系为“Dhfr-”和“GS”系统，基于此技术的工程细胞构建流程如下：携带有目的基因和筛选标记（Dhfr、GS，或其他抗性基因neo、hygro）的质粒转染至宿主细胞后，使用相应的条件培养基筛选出重组细胞。为提高重组细胞的表达水平，可采用加压多轮筛选的策略，增加目的基因拷贝数。初筛得到的候选克隆，经悬浮、无血清驯化后，在反应器中对其生长能力、表达水平，产物质量综合评价，选择具有产业价值的细胞系冻存[8][9, 10]。最终，建立符合cGMP要求的主细胞库、工作细胞库。

• 轰轰 (2015-2-25 19:08:10)

  
  2 细胞工程技术在宿主改造中的应用
  细胞工程（cell engineering）技术可以通过对宿主细胞进行遗传改造，来提高工程细胞系的生长能力、表达水平，满足抗体药物对于产能、质量的要求[11]。近年来，此方面研究进展日新月异，甚至已经开始改变了上述（表1）宿主细胞的遗传特性。如敲除GS基因的CHO构建完成[12]，更适合GS筛选系统；化学诱变筛得到不依赖胆固醇的NS0细胞系[13]；导入抗凋亡基因的Sp2/0-Ag14更适合无血清培养表达重组抗体[14]，等。
  2.1提高细胞的生长能力、抗凋亡能力
  为提高细胞的生长能力，可过度表达抗凋亡基因。如：NS0和CHO细胞过度表达Bcl-2，可以抑制细胞线粒体凋亡途径[15]； CHO 细胞中过度表达P21、P27，，可使细胞生长周期停滞在G1 期[16]；通过过度表达E1B-19K、Aven基因[17]，或热激蛋白[18]，牛磺酸转运蛋白[19]等，能显著提高细胞活性、延长培养周期。
  为降低细胞培养过程中的副产物，对副产物代谢过程中的关键基因进行操作。如：通过上调细胞的丙酮酸羧化酶基因，下调乳酸脱氢酶基因，来减少乳酸的产生[20, 21]；通过过度表达尿素循环酶、氨甲酰磷酸合成酶、鸟氨酸氨甲酸基转移酶等，来减少氨的生成[22]。
  2.2提高重组抗体的翻译、修饰及分泌能力
  多于多数重组细胞而言，翻译、修饰及分泌是抗体的生物合成过程的限速步骤[23]。因此，可以对目的蛋白生物合成的分子伴侣进行遗传操作，也可提高宿主细胞的重组抗体表达能力。此类分子伴侣包括：蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase）、内质网氧化还原酶（Endoplasmic reticulum oxidoreductase）、重链结合蛋白（the heavy chain-binding protein ）、ERp57，GRP94、 X-盒结合蛋白1(XBP-1S)[24-26]等
  抗体的糖基化修饰对其生物活性影响显著[27]，利用细胞工程技术对宿主的糖基化修饰能力进行改造，可以提高重组临床疗效。如：敲除岩藻糖转移酶（FUT8），或过度表达乙酰氨基葡萄糖转移酶（GnT-III），可降低重组抗体糖链中的岩藻糖含量，以提高抗体药物的ADCC效应功能[28]；过度表达唾液酸转移酶，提高抗体的唾液酸含量，以提高抗体的抗炎活性[29]等。

• 轰轰 (2015-2-25 19:08:32)

  
  3高表达载体的构建与优化
  在用于抗体的表达的载体构建过程中，目的基因的简化[30]、轻重链比例优化[31]，顺式作用元件的应用等，都能提高重组抗体的表达水平。这其中载体的构建策略与载体的功能元件，对于细胞的表达能力、遗传稳定性影响最为显著，也是此领域研究的热点。
  3.1用于全抗体表达的载体构建策略
  生物合成四聚体IgG结构，需要协调表达抗体分子的轻链、重链基因。以下三种载体构建策略均有用于抗体表达的报道
  3.1.1单顺反子（mon-cistronic）载体[32][33]
  轻链、重链基因分别使用不同的载体，共转染至宿主细胞。该策略对质粒要求不高，且转染效率较高，是表达重组抗体最为常用的载体构建策略。也可将轻链基因、重链基因串联到同一载体，分别使用各自的启动子、终止子转录翻译，该方法理论上可实现轻链、重链基因的等摩尔表达。
  3.1.2双顺反子（bi-cistronic）载体[34]
  在载体构建中使用核糖体内部进入位点，在其两端串联轻链、重链基因，可实现轻、重链基因同时转录。也可在载体中使用2A肽结构，在同一阅读框架内表达氢、重链基因。
  3.1.3反式互补（trans-complementing）载体[35]
  表达轻链、重链的两个载体分别含有编码筛选标记DHFR基因的不同序列。只有当含有轻链、重链的两个载体同时转染至宿主细胞时，筛选标记DHFR才能正确表达。以此提高重组细胞的筛选效率。
  3.2 载体功能元件的最新进展
  常用的表达载体依靠随机整合至宿主基因组中来表达目的基因。整合位点的“位置效应”往往会造成目的基因的低表达或沉默。近年，出现的多种商品化的染色质开放原件（STAR?、EASE?、UCOEs?、MARs? 等），人工染色体（ACE ?）、逆转录病毒载体（GPEx?），定点整合技术（Flp‐In?、RMCETM、CompoZrTM等）等，能够克服上述随机整合的缺点。载体构建中引入这些功能元件，可大幅提高高表达克隆的比例，缩短工程细胞系的构建周期。（见表2）

• 轰轰 (2015-2-25 19:08:48)

  
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  3.3大规模瞬时转染技术的发展
  瞬时转染技术由于目的基因不需要整合到宿主的基因组中，基因拷贝数和转染效率均较稳定转染明显提高。该技术可短时间内内可积累mg~g级的样品，更适用于抗体药物研发的早期阶段。随着大规模瞬时转染技术的发展，瞬时转染的最大生产规模为100L。[37, 38]瞬时转染的大规模培养工艺中对质粒需求量很大（1~1.25ug/ml）。由于其工艺复杂、成本较高等原因，限制了该技术在抗体药物的产业化生产中的应用。
  4 克隆筛选技术的发展趋势
  克隆筛选环节需要筛选出重组细胞并将其单克隆化，传统的有限稀释法耗时、费力，筛选通量低，往往是稳定细胞系构建的限速步骤。近年来，在克隆筛选手段上出现了标记高表达克隆和高通量筛选机器等技术。[39]。借助流式细胞仪进行细胞分选[40]，或使用自动机器挑选克隆[41][42]，都能显著提高克隆筛选的通量和效率。此外，在克隆筛选策略上，利用微型反应器和毛细管电泳技术，可以在克隆筛选环节，对细胞系的表达水平、生长能力[10][43]，产物质量进行综合评价。这样就避免了单纯以目的蛋白表达量为依据，忽视候选克隆细胞系在反应器中的表现、产物质量等问题。
  4.1基于流式细胞仪的细胞分选术
  流式细胞仪细胞分选术利用流式细胞仪通过对单个细胞所激发的荧光强定量检测来实现细胞分选。它可以对单个细胞进行多参数测定，筛选通量也提高至106。为了标记出高表达克隆，该方法必须与指示蛋白、荧光标记等技术联合使用[40]。如，重组抗体的轻、重链基因分别连接不同的荧光蛋白（eYFP、eGFP），共转染细胞后，利用流式细胞仪根据两种荧光强度进行细胞分选。选取荧光强度最高的1%的细胞，其抗体的平均表达水平提高44倍[44]；利用荧光标记的氨甲喋呤与胞内四氢叶酸还原酶的定量结合，可以筛选出dhfr基因拷贝数较高的细胞[45]；也可利用“俘获抗体”将细胞分泌的抗体固定在细胞表面。再使用标记有荧光的检测抗体，借助流式细胞仪分选出高产细胞株[46]。

• zhenxin (2015-2-25 19:09:17)

  
  经典的review和专业书籍可远远不止这些。 从搂主对国内抗体形式的分析来看，还是人云亦云的成分居多。
  中国的治疗性抗体（或者说生物制药）从哪方面突围？新药？仿药？
  你查查我国几个自主抗体新药（或者扩大一下，其它生物药）的年销售额是多少，比如美妥昔，又比如恩度。
  做新药有多难？靠的是技术，似乎靠的更是机遇与关系。这几年内曾经吹遍神州的两个“世界第一“新药今何在？
  做仿药真的低成本么？一支上市参考品动则上万，光做到临床前，正正规规地做，光参考品要多少支？
  为什么中国的产业装备总是落后？
  别说产能不足，中国有的是钱，产能足起来的时候就是这个产业要崩溃的时候。
  是我们太浮躁，中国人太忙。
  其实我很想把自己的感受写一篇《中国生物制药产业冷思考〉，可惜文笔不行。

• 轰轰 (2015-2-25 19:10:00)

  经典的review和专业书籍可远远不止这些。 从搂主对国内抗体形式的分析来看，还是人云亦云的成分居多。
  
  
  关于抗体产业、抗体药物、重组抗体制备技术的文章和专业书籍（推荐下an zhiqiang 的《Therapeutic Monoclonal Antibodies From Bench to Clinic. 》）确实很多，上传的这些，是本人确实读过。结合工作实际，感觉里面观点、数据是靠谱的。能够反映行业发展水平，技术最新进展，至少不会误导战友。既有抛砖引玉的想法，也有赚点叮当的私心。

• 轰轰 (2015-2-25 19:10:18)

  中国的治疗性抗体（或者说生物制药）从哪方面突围？新药？仿药？
  
  这个问题太大，个人看法，近期还是以仿为主。原因如下
  一、抗体药物的筛选技术（核糖体展示、酵母菌展示、转基因小鼠等）已经很成熟，可以直接筛到人源化抗体，包括后续亲和力成熟都不是技术上的难题。创新药的难点在于药物靶点的发现、确认。这是需要前期基础理论研究大量的扎实工作（主要是药理学）。目前美国和欧盟上市抗体合计四十多个，但是真正的药物靶点却只有几个。发现一个药物靶点，到做成一个抗体药，往往需要十余年的时间。所以，每次有抗体药上市，nature drug discovery 都会写一个长长的story 做纪念。
  二、选择仿制药。主要是因为上市多年的抗体，其临床疗效、副作用都已经明确，生产工艺都已成熟。整个药物开发的过程风险性做小。国外的biocon/sandoz包括辉瑞这些巨头也在做biosimilar，毕竟这个市场份额太大了。但是，做仿制药也不是难么简单。一方面，欧盟、美国biosimilar的监管政策还不成熟。另一方面，证明生物相似性需要大量的实际工作。如战友所说，原研药就需要买很多。但是，这不是真正的难点。难点在于对于生物大分子的抗体，永远不可能和原研药做的一样。但是，存在的差别是可接受的。如何证明这一点是开发biosimilar的难点。
  另外，目前大家更倾向于研究me better 而不是me too，虽然也是仿制药，但又往前走了一步。
  三、目前，国内的抗体产业尚处于起步阶段，资本市场不允许药品研发的“试错”。这一点也是主要原因。

• 轰轰 (2015-2-25 19:10:37)

  你查查我国几个自主抗体新药（或者扩大一下，其它生物药）的年销售额是多少，比如美妥昔，又比如恩度。
  
  我一直关注国内上市抗体和进入临床阶段抗体。目前能够公开查到的信息看，多数厂家以仿制药为主。恩度不太清楚。enbrel这个品种，国内上市的恩利、强克、益赛普，进入临床不下五家，处于研发的更多了。

• 轰轰 (2015-2-25 19:11:05)

  做新药有多难？靠的是技术，似乎靠的更是机遇与关系。这几年内曾经吹遍神州的两个“世界第一“新药今何在？
  
  重组抗体作为生物大分子，需要上市后大量临床证明其有效性和安全性（主要是免疫原性）。有些品种肯定经不起临床考验的。

• 轰轰 (2015-2-25 19:11:21)

  做仿药真的低成本么？一支上市参考品动则上万，光做到临床前，正正规规地做，光参考品要多少支？
  
  药物研发的风险很大，难以用金钱去衡量。从这个角度说，仿制药的成本是低的。可以给出了行业内的量化标准。一个抗体仿制药从细胞株构建、工艺开发，制剂开发，临床前动物实验、报批资料准备，“全套”差不多两千万人民币。这是CRO给出的报价，仅供参考。

• 轰轰 (2015-2-25 19:11:41)

  为什么中国的产业装备总是落后？
  
  装备落后的局面正在改观，投资过亿的厂家大有人在。几年前几千升的发酵罐就有了。相对于装备，行业内的某些关键技术更为重要。比如培养工艺开发，比如质量研究等等。

• 轰轰 (2015-2-25 19:12:08)

  别说产能不足，中国有的是钱，产能足起来的时候就是这个产业要崩溃的时候。
  
  这个市场太大了，想想某些品种的重组蛋白生产能力需求要数百公斤。
  考虑到目前国内的行业水平，以及重组蛋白药物市场需求。类似维生素、抗生素，这种“产能足起来的时候就是这个产业要崩溃的时候”，短期内不会出现。

• 轰轰 (2015-2-25 19:12:35)

  4.2 用于克隆筛选的自动筛选机器
  激光分析过程系统（Laser-enabled analysis and processing）利用细胞分泌蛋白形成的图像确定克隆表达水平，并使用脉冲激光清除低表达克隆。其他自动筛选机器（如ClonePixTM，CellCelectorTM，CelloTM）根据细胞在半固定培养基中形成的斑点大小，对细胞的表达能力与生长特性进行评价实现自动分选[41]。
  5 展望
  上世纪九十年代发展起来“基因共扩增”技术，已经在稳定细胞系构建中得到广泛的应用。但是，在此后的产业化实践发现，基于此原理的的Dhfr、GS表达系统普遍存在着重组克隆差异性大、表型稳定性差等问题。通过对重组细胞的目的基因拷贝数、mRNA、基因整合位点进一步发现：重组抗体的表达水平与基因拷贝数并不总是正相关。过多的外源基因拷贝数会导致重组细胞代谢负荷加大，生长能力减弱。此外，基因插入位点的“位置效应”，宿主的转录、翻译能力，也会影响重组抗体的表达水平。[30, 47, 48]目前，最新的克隆筛选策略开始尝试以轻、重链mRNA水平为指标，预估重组细胞的表达水平、质量差异[49]。。
  此外，近年来对高产细胞系的转录组、蛋白组、代谢组的研究发现：重组细胞表达异源蛋白能力的高低，不能简单的归结为若干个关键基因的作用。成就一株高产细胞系，往往是细胞的能量代谢、氧化还原电位、生长能力，蛋白加工能力等诸多特性，以网络的形式综合作用的结果[50]。对高产细胞的组学研究，加深了业内对动物细胞表达异源蛋白机制的认识，可以预见：组学技术的前瞻性指引，结合宿主细胞遗传改造，以及高通量筛选技术的应用，将是未来高产细胞系构建工作的发展方向。
  感谢关注，欢迎讨论！

• bamboo16 (2015-2-25 19:12:52)

  
  好贴，必须要顶。
  
  国内生物仿制药行业要在关键技术：动物细胞大规模培养工艺，大规模纯化工艺，质量控制三个方面进行突破，好在每个月都有国外大型制药公司的负责人回国，带来了不同方面的技术。
  只是目前国内泡沫吹得太大，能安心下来做的人太少了。