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HPLC使用过程中常见问题及解决方法

2015.3.18

  1.保留时间重现性不好

  保留时间不重现还会影响到峰面积的重现性,导致实验无法进行。引起这种现象因素很多,建议检查以下几个方面:

   -确认流动相是新鲜配置的,比例没有错误。

   -确认色谱柱是好的。

   -检查一下溶剂瓶里的溶剂过滤器没有长菌,没有被堵塞。

   -如果您使用梯度洗脱方法,请确认平衡时间足够长。

   -仔细观察柱前压得变化,如果压力稳定,就可以判断泵的系统没有问题,请更换新的色谱柱试试。

   -如果是压力不稳定,一定会影响保留时间。解决方法请参见第2条

  2.柱前压不稳定,压力上下波动

  引起这种故障最常见的原因是泵里有气泡,建议用以下的方法排除。

  -如果您的系统没有配置脱气机(二元泵),溶剂一定要经常超声脱气。

  -脱气机的效率不够,特别是用甲醇/水的系统最容易发生。可以将A,B通道串联;C,D通道串联用来延长脱气的时间,效果非常明显。

  -主动阀阀芯污染。 可以将阀芯取下,用甲醇超声清洗。

  3.排气阀里的过滤经常芯堵塞

  如果是排气阀里的过滤芯堵塞引起的压力升高,请仔细检查一下换下来的过滤芯。正常情况下,一个过滤芯可以使用6个月左右,如果经常更换就有问题。

  -如果过滤芯的颜色发黑,说明是被柱塞密封垫磨损下来的碎屑堵塞的,请确认流动相使用的缓冲盐的浓度是否太高了,是否使用了柱塞清洗装置。 缓冲液在泵头内部析出的盐的结晶会加速密封垫的磨损。

  -如果过滤芯的颜色是乳白色的,非常干净。说明过滤芯很有可能是被流动相污染了。 请检查一下您是否使用了过期的溶剂(水,有机溶剂),或质量不好的溶剂。请马上更换别的品牌的溶剂或使用纯净水(推荐:娃哈哈纯净水)。如果流动相经过了滤膜过滤,请确认是否使用了正确的,优质的滤膜。建议您先不要使用滤膜过滤流动相,看看是否可以解决过滤芯堵塞的问题。

  -如果存放缓冲液或水的溶剂瓶不经常清洗,该通路会生长藻类,藻类会污染整个流路系统和脱气机的腔体,藻类及其代谢产物也会堵塞过滤芯。如果发生了这种情况,建议用60度的热水清洗溶剂瓶,并用异丙醇清洗整个管路和脱气机。建议以后一定要用棕色瓶存放缓冲溶液,避光,并且定期清洗溶剂瓶。

  4.峰面积或峰高重现性不好,偏差大

  如果HPLC系统配有自动进样器,这种情况主要是自动进样器的问题。

  -首先确认柱前压是稳定的,保留时间的重现性好(参见第1,2条)

  -将自动进样器的抽样速度降低到50ul/min以下 (默认值是200ul/min).您的样品有可能粘度较大,降低抽样速度可以极大地改善粘度较大的样品的进样精度。

  -如果进样针或针座有轻微的堵塞,对进样精度的影响也非常大。请参考第 5条的处理办法。

  -如果是手动进样器,请确认一定要使用Agilent配的标准进样针,且进样器的废液出口要与进样口水平,避免虹吸的影响。如果是满Loop进样,建议注射5倍Loop的进样体积。

  5.自动进样器的针头或针座经常堵塞,如何处理?

  -如果针头或针座经常堵塞,请检查您所使用的进样瓶隔垫。质量不好和已经破损的隔垫易产生很多碎屑。进样时,这些细小的碎屑很容易将针头,针座堵塞。使用Agilent的正规隔垫并且经常更换旧的隔垫就可以避免这类问题。

  -如果您的样品经过离心处理,用针头吸取上清液进样, 请将针头进样位置提高。

  -如果针头或针座发生了堵塞,可以用以下简单的办法处理:通过Chemstation诊断界面的更换针头,针座的程序将其取下,反接到泵的出口,用反吹的办法将其疏通。 大部分是可以顺利解决的。

  6.紫外检测器(DAD,VWD)信号波动大,噪音大,光强度检测通不过,如何处理?

  引起这种问题的因素很多,要一步一步排除,直到找到问题真正原因。

  -确定柱前压稳定;溶剂(高纯度的有机溶剂, 水)使用正确,流动相脱气良好(请参考第2条);

  -检查检测器的氘灯是否已经到了使用寿命,是否更换过新的氘灯。

  -用异丙醇清洗整个系统,更换过滤芯,排除污染源。

  -清洗流动池和有关的透镜(需要工程师去现场服务)

  7.HPLC出“鬼峰”,如何排除?

  HPLC 出“鬼峰” 大部分发生在反相体系(甲醇, 乙腈, 水),是溶剂被污染造成的。还有一种原因是进样系统有残留。

  -让用户运行一个空白梯度洗脱的方法,从100%水过渡到100%有机溶剂,如果“鬼峰”出现,可以判断是水被污染了(水中有藻类Algae的污染)。如果用户是使用纯水机制作的水,这种现象是最常见的。建议用户更换“娃哈哈”纯净水。

  -进样系统有残留很容易判断,建议用户加强或改善洗针程序,延长冲洗Loop的时间。

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