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【讨论帖】大肠杆菌死亡破菌之后其胞内抗抗生素的...
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最近做一蛋白表达，是大肠杆菌诱导表达。
WB检测结果表明：
1。诱导前没有目的蛋白表达
2。诱导4h后，破菌上清、沉淀均有目的蛋白
3。诱导6h后，破菌上清、沉淀也均有目的蛋白
4。诱导过夜后，破菌上清、沉淀均没有目的蛋白
上述4个时间点的取样体积相同，破菌操作相同，上样量（体积）相同。
见下图
同室的博士提出下面的观点：虽然在表达过程中加有抗生素，但是表达菌中有些菌是不含带目的基因的质粒，到最后这种不含质粒的菌占优。他的这种观点是基于菌内抗抗生素的相关物质在其死亡破裂之后是可以进入到活的大肠杆菌内的。
本人是想这些抗性基因编码的活性物质多是些蛋白类物质，那它又如何通过大肠杆菌的？尤其是周质间隙的那两层膜？即便是过去了，其结构是不是也变了啊？不知这些抗性基因编码的活性物质的半衰期又是多少？
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最新回复
wood533 (2014-3-08 15:11:45)
很奇怪的解释。。。没有考虑过，倒是一般的解释是由于时间过长产生大量蛋白酶，使蛋白降解了
不清楚，欢迎讨论，仅供参考！
IAM007 (2014-3-08 15:12:29)
yychen (2014-3-08 15:12:59)
我需要知道的是：1，你重复这个实验多少次？2，你的蛋白属于什么酶类？
gemei0115 (2014-3-08 15:15:24)
诱导过夜的没做过，最长是诱导到8小时，4h,6h,8h,目的蛋白浓度一个比一个高，梯度明显。个人想不出什么理由。若是蛋白降解只要抗原表位没有破坏，western照样应该有结果吧？楼主可以试一下，看看低分子量处western有带没有（当然若是抗体太贵就当我没说）。
另外，楼主本身的问题我没大看懂。即便贵试验室的博士说的正确，即降解抗生素的酶类可以进入到其他菌体，这能解释wb无带的现象么？前六个小时积累的蛋白呢？
IAM007 (2014-3-08 15:17:24)
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我的实验没有重复做， 蛋白本身不是酶类。
IAM007 (2014-3-08 15:17:49)
另外，楼主本身的问题我没大看懂。即便贵试验室的博士说的正确，即降解抗生素的酶类可以进入到其他菌体，这能解释wb无带的现象么？前六个小时积累的蛋白呢？
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我的蛋白上带有his-tag所以就用抗his的一抗（天根抗体）。
博士的观点是可以解释WB无带的：菌体生长到最后，不含带目的基因质粒的菌占优，这就是说大多数菌内不表达目的蛋白，而含有带目的基因质粒的菌在前六小时是表达目的蛋白，而后来就死掉了从而将蛋白释放出来到培养基了，我最后收集的菌即便有目的蛋白 ，但由于量少而检测不出。
831226 (2014-3-08 15:18:41)
本人认为你们室博士的解释有点牵强啊!
如果是你们所说的那种解释的话,可以用实验进一步证实.诱导4,6,8h均可检测到蛋白,那么在随后的诱导时间内可以向培养基中追加抗生素以杀死不含目的基因质粒的菌,诱导完毕后再检测看结果如何.
若是因为降解了而检测不到也不太可能吧,WB很灵敏的,只要还存有ug级的蛋白即可检测到的,不会降解的一点都不剩吧!
为什么用WB的方法检测诱导蛋白呢?考染检测不到吗?建议跑个考染图看看总蛋白及目的蛋白或做个WB的内参对照,保证各孔的上样量再做考虑.
找到原因后记得回复个帖子,很想知道为何会出现该现象!
IAM007 (2014-3-08 15:19:17)
如果是你们所说的那种解释的话,可以用实验进一步证实.诱导4,6,8h均可检测到蛋白,那么在随后的诱导时间内可以向培养基中追加抗生素以杀死不含目的基因质粒的菌,诱导完毕后再检测看结果如何.
若是因为降解了而检测不到也不太可能吧,WB很灵敏的,只要还存有ug级的蛋白即可检测到的,不会降解的一点都不剩吧!
为什么用WB的方法检测诱导蛋白呢?考染检测不到吗?建议跑个考染图看看总蛋白及目的蛋白或做个WB的内参对照,保证各孔的上样量再做考虑.
找到原因后记得回复个帖子,很想知道为何会出现该现象!
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就是因为考染看不到，才做的WB。通过WB我们估计1L的表达量在1mg左右。至于WB的内参，我们选用了以前纯化过的带His-tag的一个蛋白做相对内参。
另：his-tag 如果掉了的话，应该就检测不到了。我用的是抗HIS的一抗。
下面是以前做的诱导2h,4h的SDS-PAGE。可是分不清哪个是目的蛋白(软件测11kD，实际可看我上面的WB图)
82500376.jpg
IAM007 (2014-3-08 15:20:15)
后来直接就用Overnight autoinduction express instant TB medium 过夜培养了，接着就做了一步纯化，感觉效果不怎么样。
最后还是硬着头皮做酶切了，酶切之后也出现了一些问题，就是找不到酶切后的带了，都找不到方法来检测了。见下图：
11723754.jpg
小野花 (2014-3-08 15:20:40)
比较赞同楼上的想法。你做得是的分子量的蛋白电泳么？感觉条带位置很偏下，如果有降解的话，更小的条带就检测不到了。根据WB图中的结果来看，你的蛋白的表达量不高（应该说是比较低了），这样的的情况下，SDSPAGE上面看不到条带也是很正常的。
yayya (2014-3-08 15:21:15)
能否告知我们你的表达载体,宿主菌及诱导剂等?
大家交流一下!
uuooii (2014-3-08 15:21:35)
IAM007 (2014-3-08 15:22:03)
QUOTE:
表达载体pet22b(+)，宿主菌BL21(de3)，诱导剂：IPTGIAM007 (2014-3-08 15:24:44)
QUOTE:
还是不太清楚，有没有这方面的具体文献啊。yes4 (2014-3-08 15:25:02)
看蛋白质表达手册 上面说的很详细
avi317 (2014-3-08 15:25:20)
个人认为，你那个大肠杆菌在4，6小时时成指数生长或者已经到达平台期，过夜后可能处于衰退期，外源蛋白产量下降不说，还会产生蛋白酶将目的蛋白降解。过夜后的样品跑的带完全没有吗？能不能观察到拖带？
IAM007 (2014-3-08 15:25:41)
QUOTE:
你说的降解可能是存在的（刚才打电话问了MERK的技术支持，也提到这一点）。因为表达量少，跑了SDS-PAGE很难分辩出目的蛋白，就做了WB来判断表达。yayya (2014-3-08 15:26:18)
不知楼上的诱导过夜培养是不是在低温条件下进行的,我们用pET22b载体构建的克隆,经IPTG诱导表达后都能得到较好的表达水平,不知你的表达量为何会那么少?过夜培养,检测的也相当好!附一张我们做的考染图!
不知你们表达的蛋白对宿主菌本身有没有毒性?另外,请教一下,你们培养上清中的蛋白是如何浓缩后检测的?怎么上清中的蛋白比总蛋白还多呢?(是上样量的差异吗?)
91077522.snap.jpg
IAM007 (2014-3-08 15:26:53)
QUOTE:
37度表达的．毒性肯定会有的．培养上清中的蛋白我们没有跑电泳，我说的是破菌上清，可能没有说清楚．
其实不同的蛋白之间差异太大了，我以前也做过一种蛋白的表达，效果很好见下图
10756148.snap.jpg
pou (2014-3-08 15:27:26)
任何观点最好有试验验证或排除才能得到大家认同。你们博士观点很深奥，本人知识面窄了些，看不懂。不知他可有试验方案验证他的观点。
本人比较同意SmallDonkey的观点，如果您有时间及兴趣，可以37度诱导6-8小时后，18度低温过夜，看看目的蛋白可有降解？
不同蛋白片断在同一载体或者是同一蛋白在不同载体的表达量肯定会有差异，所以本人感觉beaverzhang97的“我们用pET22b载体构建的克隆,经IPTG诱导表达后都能得到较好的表达水平,不知你的表达量为何会那么少?”这个问题不好。
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