【求助】 PCR产物量求助。。求大虾建议。。

最近在做pcr关于PCR体系的最适条件摸索。。小弟初始接触PCR。。
请大侠们指教下在摸索过程中少走弯路的建议。。谢谢!
这是上次做的PCR的退火梯度温度依次是(56,55.4,54.4,52.8,50.9,49.5,48.5,48.0),
目的条带有430个bp,效果感觉产物好少,Marker也跑得不亮。。。
(图片中共2个样,前8个是一个样的梯度,后八个是另一个样的梯度,maeker用的是DL2000)


GHRH_E2 20120513.jpg


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  • 阿拉蕾 (2015-3-10 22:30:31)

    PCR体系如下(25微升):                              PCR循环如下:
    ddH2O:10.1                                                     95℃  5min
    mix:13.0                                                          95℃  1min                   ━┓
    P上:0.5                                                          TM(梯度56-48)  1min       ┃*35循环
    P下:0.5                                                          72℃ 50s                      ━┛
    DNA:0.8                                                           72℃ 10min
    Taq酶:0.1

    PCR产物如上图,是不是模板加少了?使PCR产物量不高?
    此外,引物报告单给的TM是50.7-48℃
    生物秀卧虎藏龙,求各位大大解答。鄙人不胜感激。
    第一次发帖,排版不好,见谅……谢谢大家!
  • jiushikeshui371 (2015-3-10 22:30:50)


    建议引物pcr温度提高点,2度一个梯度,模板可以多加点,产物不多会不会是酶的问题,taq系列酶的话,应该会很亮的,pfu的话正常
  • newway (2015-3-10 22:32:02)


    你的mix中没有酶的吗?如果没有可以加0,2ul试试。模板可以找一个你觉得比较好的温度(按上面的那个用56就可以)做一个梯度找出最适浓度啊,pcr体系中离子浓度高了也会影响的。
  • 阿拉蕾 (2015-3-10 22:33:15)

    QUOTE:

    原帖由 newway 于 2015-3-10 22:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    你的mix中没有酶的吗?如果没有可以加0,2ul试试。模板可以找一个你觉得比较好的温度(按上面的那个用56就可以)做一个梯度找出最适浓度啊,pcr体系中离子浓度高了也会影响的。 ...
    mix里面没有酶,老师说换下taq酶,因为这次的taq酶是自制的,老师自己做ERV的PCR效果很好,但是我做就不行。。然后今天下午换了taq酶,然后把模板量改到了1微升,效果不错,唯一的就是温度梯度区分不大。。还要摸索。。谢谢了。。
  • 阿拉蕾 (2015-3-10 22:34:57)

    QUOTE:

    原帖由 jiushikeshui371 于 2015-3-10 22:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    建议引物pcr温度提高点,2度一个梯度,模板可以多加点,产物不多会不会是酶的问题,taq系列酶的话,应该会很亮的,pfu的话正常
    嗯,确实是taq酶的问题,换了一个(因为之前的是老师自制的,老师自己用效果不错)模板量也要增加。谢谢了。。O(∩_∩)O
  • zhenxin (2015-3-10 22:35:23)


    这个样子很正常 不错了 你的引物特异性挺好的,你可以尝试一下多加10个寻欢,亮度应该会提高挺多!
  • cbou876 (2015-3-10 22:35:51)


    多加循环量应该就会多了。
  • jiushikeshui371 (2015-3-10 22:39:28)

    QUOTE:

    原帖由 阿拉蕾 于 2015-3-10 22:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    嗯,确实是taq酶的问题,换了一个(因为之前的是老师自制的,老师自己用效果不错)模板量也要增加。谢谢了。。O(∩_∩)O
    呵呵,不客气,cuturl('http://bbs.bbioo.com/blog-140946-34185.html')这个有很多PCR的,可以看看
  • 阿拉蕾 (2015-3-10 22:41:11)

    QUOTE:

    原帖由 zhenxin 于 2015-3-10 22:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    这个样子很正常 不错了 你的引物特异性挺好的,你可以尝试一下多加10个寻欢,亮度应该会提高挺多!
    是用来做SSCP的,只是产物比较少,我觉得35个循环已经很多了呀。。。
  • dreaming (2015-3-10 22:45:14)


    我看了一下你做得条带其实还是不错的,我就是做PCR工作的。建议你:预变性时间缩短至3分钟,下面的变性30秒,复性30秒,退火因为你片断比较短,30秒足够,后延伸7分钟就可以了,总循环:24。总体积你可以尝试50UM体系。
    我是在生物公司专门作全基因合成的,有疑问可以联系我。
  • XYZQ (2015-3-10 22:45:31)


    个人经验感觉就是你的时间不对。你这个很小的片断,不要当成是好几K的来做,时间长/循环多,不见得做出来的就好。
  • tianmei001 (2015-3-10 22:48:03)


    还可以了,跟你的MARKER的亮度差不多。两方面考虑,一、你引物特异性跟退火温度;二、凝胶成像系统焦距调整。
  • quiqui008 (2015-3-10 22:58:58)

    你按以下几点试试:
    1、测一下模板浓度,普通PCR模板浓度10ng-100ng之间效果比较好,浓度高所含杂质的外界因素影响就比较大,效果反而不好;
    2、给你个屡试屡爽的体系:ddH2O:14.6ul; buffer:2ul;dNTP0.6ul(根据目的片段大小而定,0.6对你这个片段足够了);PrimerF0.4ul(浓度10p-100p皆可);PrimerR0.4ul(浓度10p-100p皆可);模板DNA:10ng-100ng浓度1ul;Taq酶1ul。总体积是20ul,可以根据你的目的片段的大小在ddH2O和dNTP之间进行调节。注意:这是20ul的体系,不要为了增加PCR产物按比例调到50ul,那样反而效果不好,要想扩大产物多做几个PCR即可,呵呵
    3、引物设计GC含量50%左右为佳,退火温度直接55度即可,不用调来调去;变性和退火时间10S足够,你这个片段延伸时间25S足够,循环数尽量多点,这样可以补充引物效率不高的缺点,35个循环也就个把小时。
    祝你成功!
  • quiqui008 (2015-3-10 23:00:39)

    根据你的目的,帮你设计个体系,你可以试下:
    1、94度:3min
    2、94度10S,55度10S(GC含量50%左右),72度25S(35循环)
    3、72度4min
  • baidukk (2015-3-10 23:02:02)

    我看了一下你做得条带其实还是不错的,我就是做PCR工作的。建议你:预变性时间缩短至3分钟,下面的变性30秒 ...

    ======================================================

    本人接下来要做Pcr,很可能会遇到不少问题,希望高手能不吝赐教啊!
  • hold住 (2015-3-10 23:02:55)


    循环过多产物发生突变的概率大些,一般30cycle.
  • hyuu (2015-3-10 23:04:43)

    有个疑问?你不是说在做梯度PCR吗?为什么你的结果会是这样?

    难道PCR反应的结果与退火温度无关?!
  • 阿拉蕾 (2015-3-10 23:05:11)

    QUOTE:

    原帖由 hyuu 于 2015-3-10 23:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    有个疑问?你不是说在做梯度PCR吗?为什么你的结果会是这样?

    难道PCR反应的结果与退火温度无关?!
    是梯度。。我也觉得奇怪。。。