【求助】 PCR产物量求助。。求大虾建议。。

最新回复

• 阿拉蕾 (2015-3-10 22:30:31)

  PCR体系如下（25微升）：                              PCR循环如下：
  ddH2O:10.1                                                     95℃  5min
  mix:13.0                                                          95℃  1min                   ━┓
  P上：0.5                                                          TM(梯度56-48)  1min       ┃*35循环
  P下：0.5                                                          72℃ 50s                      ━┛
  DNA:0.8                                                           72℃ 10min
  Taq酶：0.1
  
  PCR产物如上图，是不是模板加少了？使PCR产物量不高？
  此外，引物报告单给的TM是50.7-48℃
  生物秀卧虎藏龙，求各位大大解答。鄙人不胜感激。
  第一次发帖，排版不好，见谅……谢谢大家！
  

• jiushikeshui371 (2015-3-10 22:30:50)

  
  建议引物pcr温度提高点，2度一个梯度，模板可以多加点，产物不多会不会是酶的问题，taq系列酶的话，应该会很亮的，pfu的话正常

• newway (2015-3-10 22:32:02)

  
  你的mix中没有酶的吗？如果没有可以加0,2ul试试。模板可以找一个你觉得比较好的温度（按上面的那个用56就可以）做一个梯度找出最适浓度啊，pcr体系中离子浓度高了也会影响的。

• 阿拉蕾 (2015-3-10 22:33:15)

  QUOTE:

  原帖由 newway 于 2015-3-10 22:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  你的mix中没有酶的吗？如果没有可以加0,2ul试试。模板可以找一个你觉得比较好的温度（按上面的那个用56就可以）做一个梯度找出最适浓度啊，pcr体系中离子浓度高了也会影响的。 ...

  mix里面没有酶，老师说换下taq酶，因为这次的taq酶是自制的，老师自己做ERV的PCR效果很好，但是我做就不行。。然后今天下午换了taq酶，然后把模板量改到了1微升，效果不错，唯一的就是温度梯度区分不大。。还要摸索。。谢谢了。。

• 阿拉蕾 (2015-3-10 22:34:57)

  QUOTE:

  原帖由 jiushikeshui371 于 2015-3-10 22:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  建议引物pcr温度提高点，2度一个梯度，模板可以多加点，产物不多会不会是酶的问题，taq系列酶的话，应该会很亮的，pfu的话正常

  嗯，确实是taq酶的问题，换了一个（因为之前的是老师自制的，老师自己用效果不错）模板量也要增加。谢谢了。。O(∩_∩)O

• zhenxin (2015-3-10 22:35:23)

  
  这个样子很正常 不错了 你的引物特异性挺好的，你可以尝试一下多加10个寻欢，亮度应该会提高挺多！
  

• cbou876 (2015-3-10 22:35:51)

  
  多加循环量应该就会多了。

• jiushikeshui371 (2015-3-10 22:39:28)

  QUOTE:

  原帖由 阿拉蕾 于 2015-3-10 22:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  嗯，确实是taq酶的问题，换了一个（因为之前的是老师自制的，老师自己用效果不错）模板量也要增加。谢谢了。。O(∩_∩)O

  呵呵，不客气，cuturl('http://bbs.bbioo.com/blog-140946-34185.html')这个有很多PCR的，可以看看

• 阿拉蕾 (2015-3-10 22:41:11)

  QUOTE:

  原帖由 zhenxin 于 2015-3-10 22:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  这个样子很正常 不错了 你的引物特异性挺好的，你可以尝试一下多加10个寻欢，亮度应该会提高挺多！
  

  是用来做SSCP的，只是产物比较少，我觉得35个循环已经很多了呀。。。

• dreaming (2015-3-10 22:45:14)

  
  我看了一下你做得条带其实还是不错的，我就是做PCR工作的。建议你：预变性时间缩短至3分钟，下面的变性30秒，复性30秒，退火因为你片断比较短，30秒足够，后延伸7分钟就可以了，总循环：24。总体积你可以尝试50UM体系。
  我是在生物公司专门作全基因合成的，有疑问可以联系我。

• XYZQ (2015-3-10 22:45:31)

  
  个人经验感觉就是你的时间不对。你这个很小的片断，不要当成是好几K的来做，时间长/循环多，不见得做出来的就好。

• tianmei001 (2015-3-10 22:48:03)

  
  还可以了，跟你的MARKER的亮度差不多。两方面考虑，一、你引物特异性跟退火温度；二、凝胶成像系统焦距调整。

• quiqui008 (2015-3-10 22:58:58)

  你按以下几点试试：
  1、测一下模板浓度，普通PCR模板浓度10ng-100ng之间效果比较好，浓度高所含杂质的外界因素影响就比较大，效果反而不好；
  2、给你个屡试屡爽的体系：ddH2O：14.6ul; buffer:2ul;dNTP0.6ul(根据目的片段大小而定，0.6对你这个片段足够了）；PrimerF0.4ul(浓度10p-100p皆可）;PrimerR0.4ul(浓度10p-100p皆可）；模板DNA：10ng-100ng浓度1ul;Taq酶1ul。总体积是20ul,可以根据你的目的片段的大小在ddH2O和dNTP之间进行调节。注意：这是20ul的体系，不要为了增加PCR产物按比例调到50ul，那样反而效果不好，要想扩大产物多做几个PCR即可，呵呵
  3、引物设计GC含量50%左右为佳，退火温度直接55度即可，不用调来调去；变性和退火时间10S足够，你这个片段延伸时间25S足够，循环数尽量多点，这样可以补充引物效率不高的缺点，35个循环也就个把小时。
  祝你成功！

• quiqui008 (2015-3-10 23:00:39)

  根据你的目的，帮你设计个体系，你可以试下：
  1、94度：3min
  2、94度10S，55度10S(GC含量50%左右），72度25S（35循环）
  3、72度4min

• baidukk (2015-3-10 23:02:02)

  我看了一下你做得条带其实还是不错的，我就是做PCR工作的。建议你：预变性时间缩短至3分钟，下面的变性30秒 ...
  
  ======================================================
  
  本人接下来要做Pcr，很可能会遇到不少问题，希望高手能不吝赐教啊！

• hold住 (2015-3-10 23:02:55)

  
  循环过多产物发生突变的概率大些，一般30cycle.

• hyuu (2015-3-10 23:04:43)

  有个疑问？你不是说在做梯度PCR吗？为什么你的结果会是这样？
  
  难道PCR反应的结果与退火温度无关？！

• 阿拉蕾 (2015-3-10 23:05:11)

  QUOTE:

  原帖由 hyuu 于 2015-3-10 23:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  有个疑问？你不是说在做梯度PCR吗？为什么你的结果会是这样？
  
  难道PCR反应的结果与退火温度无关？！

  是梯度。。我也觉得奇怪。。。