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序列捕获之新品荟萃

2012.11.25

  2009年,基因组定向捕获工具的出现,让外显子组的捕获成为可能。科学家们普遍认为外显子组测序比全基因组测序更有优势,特别是对罕见的单基因疾病。不仅仅是费用更低,数据的阐释也更为简单。因此,外显子组测序也在2010年被《Science》杂志评为年度十大突破。

  数百篇已发表的文章,也证实了外显子组测序这种新兴技术的成功。它能协助确定单基因疾病的分子缺陷,鉴定各种癌症中反复突变的基因,并为人类进化和群体遗传学提出新见解。

  目前,不仅仅是小型实验室基于成本考虑会开展序列捕获,即使是资金雄厚的华大基因、Broad研究院和Sanger研究院,也会采用序列捕获技术。

  序列捕获有两种基本方法:PCR法和杂交法,后者可以液相开展,也可以在芯片表面开展。罗氏NimbleGen最早推出了序列捕获芯片,之后又推出液相外显子组序列捕获,为各种项目提供灵活的可扩容性。安捷伦很早也瞄准了这个市场,推出了不少好产品。如今,Illumina、Life Technologies、RainDance等公司也有新产品呈上。

  杂交捕获

  安捷伦、罗氏和Illumina等厂家提供液相捕获工具。这些产品都是基于液相杂交选择(SHS),利用一组生物素化的寡核苷酸来捕获测序文库中感兴趣的一部分。通过链霉亲和素磁珠pull-down和洗涤之后,杂交片段被释放,并立即可用于测序。

  安捷伦的SureSelect技术是基于120-mer的RNA寡核苷酸。最新版本的SureSelect Human All Exon V4外显子组捕获试剂盒经过全面升级,能够全面覆盖主要的基因组数据库,包括 CCDS、RefSeq 和 GENCODE。试剂盒有两种,一种只捕获外显子,覆盖51 Mb;另一种捕获外显子和非翻译区,覆盖71 Mb。

  安捷伦今年又推出了SureSelect XT 人甲基化测序系统,适用于表观遗传学研究中 DNA 甲基化位点检测。该系统针对启动子、经典的CpG岛以及最近被关注的位于CpG岛上下游2kb范围内的“shores”和“shelves”区域而设计,让研究人员能够分析超过370万个CpG 核苷酸序列位点,研究它们的甲基化状态。除上述区域外,SureSelect XT 甲基化测序系统的设计还包含了已知的差异性甲基化区域。

  与全基因组亚硫酸盐测序相比,SureSelect XT 甲基化测序系统具有更高的通量,且成本更低。它可以识别限制性内切酶或免疫沉淀法不能检测的区域。马克斯普朗克分子遗传学研究所的Michal-Ruth Schweider医学博士认为,SureSelect XT 甲基化测序系统涵盖了所有基因组中癌症研究领域关注的甲基化胞嘧啶位点,投入产出比相当好。

  罗氏也于去年年底推出了全基因组外显子液相捕获的三代产品。NimbleGen SeqCap EX Exome Library v3.0可捕获64M的基因组序列,包括所有外显子以及miRNA,它含与其他NimbleGen液相捕获产品相同的2.1M高密度探针,以确保高效、均一、特异、全面的定向捕获。

  不久前,NimbleGen序列捕获产品家族又添了新成员。SeqCap EZ Exome + UTR Library覆盖了外显子组和50Mb的UTR区域,总捕获目标区域高达96Mb;而另一款SeqCap EZ Exome Plus Library在原有64Mb的外显子组捕获基础上,可以由用户自行选择另外的50Mb区域进行定制设计。索取资料

  此外,NimbleGen还提供疾病定向研究方案,让您的测序目标更加明确。SeqCap EZ Comprehensive Cancer Design全面覆盖了癌症相关基因,包括与多种常见和稀有癌症相关的578个基因。SeqCap EZ Neurology Panel Design的捕获目标包括87种神经疾病的256个基因,这些疾病中包括帕金森症、阿兹海默症、孤独症、癫痫、肌萎缩侧索硬化等等。

  • Cancer Panel C 4 Mb的捕获区域,覆盖578个癌症相关基因

  • Neurology Panel C 1.5 Mb的捕获区域,覆盖87种神经疾病相关的256个基因

  Illumina如今不仅提供测序仪,也提供序列捕获方案,即TruSeq Exome Enrichment Kit,用95 bp的寡核苷酸来靶定大约62 Mb的外显子组序列,覆盖最新RefSeq的91%(2010年9月hg19 Build)以及2010年9月发布的CCDS(合作保守编码序列)的95%。索取资料

  华大基因和罗氏NimbleGen公司也联合研发出全新人类MHC区域捕获技术。该技术捕获的区域不仅覆盖了传统的3.37Mb MHC区域,并且还向上下游共扩展了约1.60Mb的区域,共计4.97Mb(chr6: 28477797-33448354),此外,该区域还包涵了目前已发现的MHC区域8个单体型信息。在覆盖度方面,该技术可覆盖高达97%以上的MHC 区域,并且对mRNA区域更是实现了几乎100%的覆盖。

  PCR捕获

  Life Technologies公司于去年推出了基于PCR的序列捕获产品。Ion AmpliSeq™ 技术突破了多重PCR的已知障碍,推出了一个开创性的流程,能实现数百个已知突变的快速测序及低频率等位基因的检测。利用10 ng DNA,只需一天,即可快速评估数百个关键突变。一管式流程如建立PCR反应般简单,任何实验室技术人员均可操作。索取资料

  Ion AmpliSeq™ Cancer Hotspot Panel v2如今已是第二版,包含207对引物,靶定50个癌基因和肿瘤抑制基因的“热点”区域,广泛覆盖KRAS、BRAF和EGFR基因,让转化和临床研究人员能够快速追踪肿瘤学研究。Ion AmpliSeq™ Comprehensive Cancer Panel 经过精心设计,可同时拷问多个基因家族中的编码DNA序列(CDS)和剪接变异体。Ion AmpliSeq™ Inherited Disease Panel则利用3个引物池共10,000多对引物,对328个基因的编码外显子进行扩增。这些基因与700多种遗传疾病相关,包括神经肌肉疾病、心血管疾病、发育疾病和代谢疾病。

  自动化平台

  RainDance Technologies借助该公司微型的液滴平台来实现序列捕获。基因组DNA样品与智能的微流体芯片上的独特引物液滴混合。在1小时内,每个样品产生超过200万个皮升大小的PCR液滴――每个都代表了一个单分子PCR反应。混合好的液滴收集在单支管中,经过热循环扩增,即可在新一代平台上开展测序。

  RainDance最初推出了RDT 1000系统,之后又推出了高通量的版本――ThunderStorm™系统。目前,多个著名的研究所都采用了ThunderStorm系统,包括马普研究院、伦敦大学癌症研究所、不列颠哥伦比亚省癌症中心等。

  据介绍,单分子液滴PCR产生了更好的序列均一性和基因组区域的更完整设计覆盖。每个PCR液滴包含了等量的基因组DNA、引物对和PCR预混液。这形成了高度均一的PCR产物,避免了传统多重PCR反应中常见的偏向。此外,每个引物对都是利用RainDanceZL的硅片引物设计来设计的,实现了目标区域中高于99%的设计覆盖度。这种特异性水平能够靶定杂交方法所不能靶定的重复和同源的基因组区域。

  自外显子组测序诞生的那一天起,就有人预言,随着全基因组测序成本的不断下降,外显子组测序不久将会销声匿迹。然而,就目前而言,外显子组测序还是具有存在的意义。外显子组测序鉴定出大约2万个变异,而全基因组测序鉴定出400万个变异。从外显子组转移到基因组,为了未知的信号增加,我们要承担 100倍的噪音增加。

  全基因组测序也将伴随着昂贵的数据储存及大量的分析数据。目前,一些临床测序中心已经有能力储存和分析大量来自全基因组测序的数据。然而,患者需要等待更长时间,对于只争朝夕的癌症患者而言,这可能不太现实。

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