新技术准确定量罕见的mtDNA缺失

2013-9-06 11:28 来源: 生物通
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  Fred Hutchinson癌症研究中心的研究人员近日发现了一种新工具,能够准确分析与多种疾病和衰老相关的极罕见线粒体DNA缺失。这项成果在线发表于《Aging Cell》杂志上。

  mtDNA突变的积累与衰老、神经肌肉疾病和癌症有着密切的关联。然而,目前的方法无法准确定量和鉴定新的缺失事件,因其发生频率非常低,正常组织中每1亿个线粒体基因组约有一个缺失事件。为了解决这些限制,研究人员开发出一种基于ddPCR的分析方法,来高分辨率地分析这些罕见缺失。他们将这种方法称为“数字缺失检测(Digital Deletion Detection)”,简称3D。

  文章的通讯作者Jason Bielas博士谈道:“研究mtDNA突变是极其困难的,更不用说缺失。我们的3D检测在特异性、灵敏度和准确性上与传统方法相比有了明显的改善。微滴式数字PCR所带来的通量增加让分析时间从数月缩短至数天。若没有这一技术,我们无法获得这一发现。”

  Bielas博士指的是Bio-Rad的QX100™ ddPCR系统。利用这一系统,研究小组分析了80亿个人类脑mtDNA基因组,并鉴定出超过10万个带有缺失的基因组。他们发现,与流行的看法相反,大多数mtDNA缺失的增加并不是由新的缺失引起的,而是之前缺失的扩增。他们推测,现有突变的扩增应当是造成mtDNA缺失积累的主要因素。

  3D是一个新颖的三步法过程,包括富集带有缺失的分子;基因组被分成单分子液滴,并通过ddPCR定量;利用新一代测序确定断裂点。

  富集完成后,通过QX100系统调整液滴中的分子浓度,让大多数液滴不含有突变基因组,而少数只有一个。这一过程允许每个缺失被无偏向地放大,而不会像qPCR那样引入误差。

  在扩增后,Bielas及他的小组利用ddPCR确定突变分子的绝对浓度。根据液滴荧光和扩增子大小之间的关系,他们能够鉴定大脑样品中罕见缺失的大小和复杂性(到底是几个克隆的扩增,还是大量随机缺失)。

  研究人员认为,3D检测作为一种重要的新工具,将有助于更好地研究缺失形成和扩增的机制,以及它们在衰老中的作用。而微滴式数字PCR的高通量和高灵敏度也让Bielas博士的实验室能够靶定骨骼肌、脑组织和血液中其他低水平的致病mtDNA缺失。