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【求助】为何看不到磷酸化的akt条带？求助！
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最近用western做AKT磷酸化的一些试验，前两次曝光后还能看到磷酸化的akt条带，但是这两次，是什么都看不到了，该出现条带的位置，什么信号都没有了！
我的大概步骤如下：
（1）大鼠冰冷PBS灌注后取脑组织，先放入冰冷PBS中，取皮层组织放在EP管内；
（2）迅速转移如-80度冰箱内，一周内提取蛋白；
（3）提取蛋白：将蛋白放在碎冰上解冻；
（4）同时准备RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂；
（5）脑组织放入玻璃匀浆器内匀浆，也是低温操作；
（6）12000转离心，并取上清；
（7）蛋白定量；
（8）与上样缓冲液混合，煮沸10分钟，冷却后-20度冻存；
（9）电泳、转膜；
（10）常温封闭1小时，一抗4度过夜（1：1000稀释）；
（11）洗膜后二抗1小时，再次洗膜；
（12）曝光
结果是actin条带非常清楚，而磷酸化的akt一点信号没有！漆黑一片！
可能步骤写的也不够详细，各位老师看看我哪些步骤有失误，哪些需要改进？
或者是根据你们的经验，从蛋白提取到曝光，哪些步骤需要特别注意，最有可能哪里出现问题呢？
谢谢大家！
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最新回复
tianmei001 (2013-5-16 11:11:41)
有没有对照样品啊？要没有对照的话不好分析出到底是样品本身就不磷酸化Akt，还是Akt的wb做的有问题。
toy (2013-5-16 11:12:11)
其次呢，最后这两次actin的条带非常清楚，而且我用的是Odyssey Infrared Imaging，actin和磷酸化的akt是要在一张膜上出来的，而且同时做的另一块
胶非磷酸化的akt也是非常清楚；
所以我个人感觉，WB应该没有问题！
希望再次指正！
fox_79 (2013-5-16 11:12:34)
toy (2013-5-16 11:12:59)
肯定不是冻融的问题！我就解冻过一次！
而且，开始做的那两次，冻融过至少5次，条带还是很清楚！
我一直怀疑是P-AKT的特殊性造成的，
第一是含量少；
第二是在基础状态下没有磷酸化，刺激处理没做好！
PINK (2013-5-16 11:13:21)
你用的p-AKT的抗体是哪个公司的？我之前也检测过p—AKT，条带很不清楚。可是AKT倒是很好
nikonun (2013-5-16 11:13:46)
NBA (2013-5-16 11:14:20)
我的大概步骤如下：
（1）大鼠冰冷PBS灌注后取脑组织，先放入冰冷PBS中，取皮层组织放在EP管内；
（2）迅速转移如-80度冰箱内，一周内提取蛋白；
（3）提取蛋白：将蛋白放在碎冰上解冻；
（4）同时准备RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂；
（5）脑组织放入玻璃匀浆器内匀浆，也是低温操作；
（6）12000转离心，并取上清；
（7）蛋白定量；
（8）与上样缓冲液混合，煮沸10分钟，冷却后-20度冻存；
（9）电泳、转膜；
（10）常温封闭1小时，一抗4度过夜（1：1000稀释）；
（11）洗膜后二抗1小时，再次洗膜；
（12）曝光
结果是actin条带非常清楚，而磷酸化的akt一点信号没有！漆黑一片！
可能步骤写的也不够详细，各位老师看看我哪些步骤有失误，哪些需要改进？
或者是根据你们的经验，从蛋白提取到曝光，哪些步骤需要特别注意，最有可能哪里出现问题呢？
谢谢大家！
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既然前两次能出来的话,实验方法倒不需要改进,应该属于某种操作错误.或试剂的PH变了之类的.
重新double check 是否试剂之类的都没有问题,有嫌疑的就重新配吧,特别是tris-hcl之类的.
然后再做一次看看.
toy (2013-5-16 11:14:48)
我的两个抗体akt和p-akt都是买的CST公司的；
我的akt条带也是非常清楚，上样量30ug就很明显了；
“虽有p-Akt条带，但不是很清楚，且非特异条带很多”，我上两次出来的p-akt条带肯定没有akt的清楚，但是非特异的也不多，只有在20kd左右有一条很亮的非特异条带！
我感觉不像是抗体的问题，非特异的条带有就有吧，能区别开就行了，关键是自己想要的要出来啊！
toy (2013-5-16 11:15:25)
重新double check 是否试剂之类的都没有问题,有嫌疑的就重新配吧,特别是tris-hcl之类的.”
我感觉实验方法的问题存在的可能性不大，即使有一些电泳和转膜参数的差别，但是也不会影响太大，更不要说一抗和二抗孵育的时间什么的，多10分钟少10分钟问题也不大！
您把失误的原因放到了试剂上面，这个可能性就更小了，因为所有的试剂，甚至包括tris-hcl，都是购买的现成的，不是自己配制的，只有胶、电泳缓冲液和转膜液是我自己配制的！
所以我个人感觉问题还是在于样品本身，所以如果哪位大侠做过动物组织的p-akt，那真是太好了！
toy (2013-5-16 11:16:58)
刚才检索CST公司网站的抗体目录，
cuturl('http://www.cellsignal.com/catalog/primary/targets_a_to_c.html')
发现p-akt的兔源的抗体至少有三个，货号分别是9271、4060、4058，都可以用于WB，而我用的是9271，当时也不知道怎么选择的，现在看了看这3个抗体的资料，也找不出有什么区别？
不知道我的问题是不是出在这里？这3个抗体到底有什么区别呢？哪位大侠有这方面的经验呢？
H2O (2013-5-16 11:17:21)
你前两次和这两次的样品有何差异呢？来源、种属是否一致？处理方法是否一致？
如果都一致，我认为最大的可能性就是有什么地方失误了，再做一次看看。
vivian4123 (2013-5-16 11:17:57)
重新double check 是否试剂之类的都没有问题,有嫌疑的就重新配吧,特别是tris-hcl之类的.”
我感觉实验方法的问题存在的可能性不大，即使有一些电泳和转膜参数的差别，但是也不会影响太大，更不要说一抗和二抗孵育的时间什么的，多10分钟少10分钟问题也不大！
您把失误的原因放到了试剂上面，这个可能性就更小了，因为所有的试剂，甚至包括tris-hcl，都是购买的现成的，不是自己配制的，只有胶、电泳缓冲液和转膜液是我自己配制的！
所以我个人感觉问题还是在于样品本身，所以如果哪位大侠做过动物组织的p-akt，那真是太好了！
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不好意思,可能没有表达清楚,我说的某种操作错误,指some mistake,是泛指操作上本身会出现的问题,包括样品的处理(比如磷酸化没有被保护好). 而不是客观存在的磷酸化本身的问题.
所以我的意思是 并不是没有磷酸化,或者您的protocol有问题(因为没有磷酸化或protocol有问题的话,前面两次也不应该出来条带)而是您的什么地方操作的问题.
good luck
mamamiya (2013-5-16 11:19:59)
我认为单克隆抗体应该比多克隆抗体好，我们买的是4060，但做出来效果也不是太好，非特异染色很多，特异性条带也不清楚，初步怀疑是抗体稀释度的问题，不知100ml一抗和二抗的稀释度各是多少？
kulee (2013-5-16 11:20:43)
我的大概步骤如下：
（1）大鼠冰冷PBS灌注后取脑组织，先放入冰冷PBS中，取皮层组织放在EP管内；
（2）迅速转移如-80度冰箱内，一周内提取蛋白；
（3）提取蛋白：将蛋白放在碎冰上解冻；
（4）同时准备RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂；
（5）脑组织放入玻璃匀浆器内匀浆，也是低温操作；
（6）12000转离心，并取上清；
（7）蛋白定量；
（8）与上样缓冲液混合，煮沸10分钟，冷却后-20度冻存；
（9）电泳、转膜；
（10）常温封闭1小时，一抗4度过夜（1：1000稀释）；
（11）洗膜后二抗1小时，再次洗膜；
（12）曝光
结果是actin条带非常清楚，而磷酸化的akt一点信号没有！漆黑一片！
可能步骤写的也不够详细，各位老师看看我哪些步骤有失误，哪些需要改进？
或者是根据你们的经验，从蛋白提取到曝光，哪些步骤需要特别注意，最有可能哪里出现问题呢？
谢谢大家！
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看完上面的回复了，你可以读读我的《WB实战指南》，我在抗体孵育章节专门以p-AKT为例，提到这个抗体最好从R&D购买（货号我没办法查了），CST的两管垃圾（总蛋白和磷酸化的）还一直扔在角落里了。
当然啦，也许站在今天的高度，可以尝试用其他的抗体稀释液再尝试下；不过如果你不想浪费时间和其他耗材，买R&D最reasonable
xingyi08 (2013-5-16 11:22:11)
我认为不能一概而论CST的抗体，当然就我自己的经验，CST的大多数抗体还是不错的，也许不是最好的，因为有一些生产兔单抗的公司做磷酸化抗体还是很强的。一下是我的图：小鼠细胞稍弱。
63847778.jpg
xingyi08 (2013-5-16 11:27:07)
CST
pS473 Cat.#：4060
pT308 Cat.#: 2965
Akt pan Cat.#: 4691
我并不是给CST打广告，而且我做的也没有datasheet上的漂亮，但确实work。
这个是人的细胞，pT308效果差不多，而Akt pan则非常漂亮，一时没有找到图。
[ 本帖最后由 xingyi08 于 2013-5-16 16:09 编辑 ]
41321728.jpg
66小飞侠 (2013-5-16 16:10:32)
我给一下我自己paper上面用R&D做的图片吧。那个CST的产品我还有点印象，就是条带位置不对呀，杂带倒是很浓。
几年前的水平，内参还做得不是很好看，呵呵
Panel A：p-AKT看起来毛楂楂的，是因为显影液有点久了，所以不是很实。
25840556.snap.jpg
toy (2013-5-16 16:11:07)
我用的是Odyssey Infrared Imaging，一抗的稀释度是1：1000，二抗的稀释度是1：5000.
toy (2013-5-16 16:12:12)
我现在下载dxy上的东西总是提示错误，很郁闷的东西！
我感觉你做的条带已经很清楚了，你说的模糊，有重影，可能也不是发光液的问题，因为akt有akt1、akt2…，而抗体说明书上已经说了和这几个都有反应的！
说真的，我从来没有怀疑过CST这个公司，没想到这个抗体R&D还是最好的！实验室的老师也是说我的某个操作有问题，但是我不礼貌的说，这跟没说一样！我还是按照你的经验试试吧！
To lee800265：
你给了我好多的建议，还把图发了上来，太感谢了！
我的akt条带甚至比actin还漂亮，但是提到p-akt我头都疼！
你的p-akt抗体还是很漂亮的，很明显看出各个处理的差别，而我呢，做的还是动物的组织，蛋白量可以很多的，但是还是未见条带，很惭愧！
小野花 (2013-5-16 16:15:03)
不知您在做WB时转膜后丽春红染色膜上是否有条带，如果有，应该就是后面流程的问题，如封闭、洗膜、一抗、二抗、显色等。还是找找原因吧。
【求助】为何看不到磷酸化的akt条带？求助！