【求助】pET32a空载体蛋白表达在哪里？

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• biabiade (2014-2-04 00:02:00)

  
  你说的上清是指什么？是细菌培养上清吗？还是指细菌裂解后所得的上清？
  通常重组蛋白表达部位分下列几种
  1)分泌性表达，表达的重组蛋白存在于培养上清或细菌的周质空间。(由于大肠杆菌有很厚的细胞壁，在分泌信号肽的引导下，重组蛋白一般分泌到细胞壁和细胞膜之间的周质空间，无法像真核生物那样分泌到培养上清里面。所以在大肠杆菌分泌性表达又叫周质空间表达。)
  2）胞质可溶性表达，表达的重组蛋白存在于细胞质中，用适宜的裂解液裂解宿主微生物后，重组蛋白存在于裂解后的上清中。
  3）包涵体表达。表达的重组蛋白也存在于细胞质中，只是由于重组蛋白聚集成不溶性的包涵体团块，所以裂解宿主微生物后，重组蛋白存在于裂解后的沉淀中，需要用强变性剂比如尿素，SDS等才能溶解。
  4）膜表面表达，这多见于细胞转导通路和表面展示技术的研究。表达的重组蛋白携带有合适的跨膜结构域，从而使其镶嵌在细胞膜上。
  5)核内表达，这多见于酵母双杂交或转录因子的研究。表达的重组蛋白携带有核定位信号，能够引导其进入细胞核发挥功能。
  PET32a空载体表达的重组蛋白主要是TRX片段，这个蛋白在通常的诱导条件下，有很大比例以可溶性形式存在于细菌的胞质里。也有部分以包涵体形式存在。

• 阳光树 (2014-2-04 00:02:22)

  你好，我说的上清是指细菌裂解后的上清。但是我用1mmol IPTG诱导4个小时，上清中什么也没有，沉淀里有东西，但是没看出是明显的表达带来。请问我该怎么修改条件？

• seagate (2014-2-04 00:02:54)

  是说什么蛋白都没有吗？怎么确认的？

• abc816 (2014-2-04 00:03:39)

  你好，我说的上清是指细菌裂解后的上清。但是我用1mmol IPTG诱导4个小时，上清中什么也没有，沉淀里有东西，但是没看出是明显的表达带来。请问我该怎么修改条件？
  
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  1mM IPTG诱导4小时可以了。如果想要可溶性比例高一点，可以试试25度诱导过夜。也可以将IPTG浓度减为0.2mM试试。
  但你说一点都没有表达，那我就感觉有点问题了。如楼上所说，不知道你是通过什么方法检测的？是SDS-PAGE电泳吗？PET32空质粒的表达产物只有大约10KD，一般的SDS-PAGE可能比较难跑出来，跑小分子量蛋白胶比较好，不知这点你有没有注意。另外不知你用什么方法裂解的，裂解效果如何。裂解后的上清，即使没有目的蛋白也应该有不少杂蛋白的。你说上清中什么也没有，是指没有任何蛋白条带吗？如果是这样，那说明你的裂解方法有问题。

• 阳光树 (2014-2-04 00:04:06)

  对不起，我没有说清楚。我是用超声裂解的，然后用SDS-PAGE电泳检测，上清和沉淀中都有蛋白条带，但是上清中明显少，而且空载体和目的基因表达情况完全相同，没有明显的表达迹象，怎么回事？
  另外，pET32a载体上应该有三个标签蛋白，S tag、His tag和Trx tag，所以空载体表达产物应该是26KD左右吧？为什么是10KD呢？请指教！

• abc816 (2014-2-04 00:04:48)

  对不起，我没有说清楚。我是用超声裂解的，然后用SDS-PAGE电泳检测，上清和沉淀中都有蛋白条带，但是上清中明显少，而且空载体和目的基因表达情况完全相同，没有明显的表达迹象，怎么回事？
  另外，pET32a载体上应该有三个标签蛋白，S tag、His tag和Trx tag，所以空载体表达产物应该是26KD左右吧？为什么是10KD呢？请指教！
  
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  不好意思，这点是我记错了，空载体的表达产物确实是26KD，我忘了还有两个TAG。从你的描述来看，实验过程应该没有问题。那么具体问题在哪只能逐项排查了。你说空载体和目的基因表达情况相同，那么空载体的诱导和非诱导组有没有差别？空载体和未转化的宿主菌有没有差别？通过观察这些可以检测你的诱导情况。另外有条件的话最好做个Western，有时表达弱的话，在众多的杂带中，可能无法分辨出来。

• bamboo16 (2014-2-04 00:05:05)

  
  有意思，上清中可能没有，可能有。通过SDS-PGAE 看不见，不能证明其没有，可能是量少检测不到而已。许多文献证明Trx可溶性表达的几率是很大的。

• 阳光树 (2014-2-04 00:05:25)

  
  空载体的诱导和非诱导组有差别，今天我用别人的pGEX-6p-1载体做对照，结果他的很容易就有表达，非常明显的表达，而我的依然没有，郁闷！我今天用25度诱导了7个小时。

• 131415 (2014-2-04 00:05:42)

  你的蛋白是不是可溶的？有没有可能在沉淀之中？能不能把沉淀跑一个电泳？

• 阳光树 (2014-2-04 00:06:03)

  沉淀也跑了，没有！

• 131415 (2014-2-04 00:06:19)

  把你的空pGEX-6p-1测个序，估计是载体出问题了。不过既然跟别人要到新载体，就不需要纠缠这些问题了。