【求助】目的条带不出

最新回复

• 婴儿脸 (2014-3-20 22:06:19)

  
  有时是这样

  
  70187181.jpg

• 婴儿脸 (2014-3-20 22:08:50)

  
  但这时β-actin也是有的

  
  44993919.jpg

• chuntian1983 (2014-3-20 22:09:17)

  1. The protein might not be abundant.
  2. Santa Cruz always recommends to use their primary antibody from 1:100-1:1000 for western blot, is that right? Can you double check your datasheet of the antibody?
  3. The antibody might not be good. Sometimes it happens. Call, describe your problem, ask them to send new batch of antibody, or change another antibody to the same protein(eg. C-20--> H300), they have good custom service.

• wu11998866 (2014-3-20 22:09:58)

  QUOTE:

  原帖由 chuntian1983 于 2014-3-20 22:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  1. The protein might not be abundant.
  2. Santa Cruz always recommends to use their primary antibody from 1:100-1:1000 for western blot, is that right? Can you double check your datasheet of the antibo ...

  同意，我也觉得是1抗的问题。
  其他条件一样的情况下，内参和目的抗体不同，结果不一样，问题一半就是出在抗体上面。

• whitesheep (2014-3-20 22:10:16)

  
  我的也是，和你一样样的，actin 很好，就是蛋白出不来。我一抗也是santa
  的，二抗是博士德。我第一次买的还有一次做出来，但后来就没有做出来。我后来就又买了一个新的，也是他们公司的，但还是出不来。什么原因阿

• ha111 (2014-3-20 22:11:01)

  
  上样量是多大
  从β－Actin来看，你的上样量有点儿小……
  如果是1.5mm*10mm的上样孔的话，上样量至少可以多达60ug，我们有时上到90ug，参考这个值再试试
  另： Actin的量差的有点儿大……

• 婴儿脸 (2014-3-20 22:11:20)

  
  谢谢大家！
  因为还有两个目的蛋白比较小，我这两天又跑了几次Tris-Tricine-SDS-PAGE电泳，用的是和这个相同的二抗，一抗也是Santa的，看说明书上写推荐浓度1：200-1：1000，我两个目的蛋白的一抗都用了1：500，二抗1：1000，但都是大黑膜，actin也出来了，难道三个一抗都有问题，那我好惨啊！
  这三个都是用的同一个二抗，而actin是另一个二抗，但这两个二抗是同一公司的，二抗会不会有问题呢？
  我用的是0.75的板，加了10 微升，不好意思，浓度没测，那我上样量小的话，是不是目的蛋白表达不高的话，会测不出来？但现在每次都是全黑Sad
  希望大家多提指导意见，谢谢！

• qhyu (2014-3-20 22:11:41)

  
  降低一抗、二抗的浓度
  我用的也是该公司的抗体，最初是用1：300，1：500，每次都是曝个黑板出来，一气之下就一抗用1：1000，过夜，4度，二抗1:5000,室温2小时，结果背景就可以了

• zranqi_1 (2014-3-20 22:32:15)

  
  最简单的
  做梯度
  上样量从10ul，20ul，30ul做梯度，一抗可以先用1：1000，二抗1：3000
  检测的是内源性蛋白还是过表达的蛋白？前者的话确定这个细胞或是组织有这种蛋白吗？后者的话确定质粒表达吗？一句话，最好用阳性对照来检测抗体，否则根本不知道是蛋白还是抗体的问题

• 婴儿脸 (2014-3-20 22:32:45)

  
  谢谢
  今天不加一抗试了试，结果什么都没有，看来就是一抗的问题了，可怎么3个一抗都有问题呀？
  现在一抗1：500，1：2000试过（推荐的是1：200-1：1000），二抗1：500，1：1000，1：1500试过（推荐的是1：200-1：500），都是全黑，最淡的一次就是我贴在1楼的那张图，那时一抗1：2000，二抗1：1500做的。不知再降低一抗二抗浓度还有希望出什么？
  蛋白是内源性的蛋白，我用的细胞中肯定有表达。用阳性对照怎么做呢?没有提纯的该蛋白呀
  我觉得如果没有表达，应该是什么也检测不出来，为什么总是黑膜呢？
  

• eric930 (2014-3-20 22:33:54)

  
  知道有表达就得，其实检测抗体的时候一般使用过表达的方法的 ，用标签抗体确定蛋白表达的情况下，再用蛋白特异性抗体检测，就是我所谓的阳性对照
  先加大蛋白上样量，按你已经试过的最大稀释倍数试下吧，背景一般而言就是封闭、抗体稀释倍数、洗膜这些原因，因为没有条带，肯定会长时间曝光以求得到条带，也会出现背景过深，其实背景和条带有时就是个相对值，条带清楚了，背景有点儿，少曝会儿光就OK了，也就不去再计较了

• 婴儿脸 (2014-3-20 22:37:17)

  谢谢。我的曝光时间不长，因为每次加上发光液就看到整张膜很亮，尤其是膜的周边特别亮，中间相比之下还暗一点，但过一会儿也整个很亮了。

• nikun230 (2014-3-20 22:39:24)

  
  1. as wfayew said, measure your protein concentraion, load more proteins. Since the actin bands are very faint, how can you expect your protein bands to be clear...
  2. Load positive control---so that you will know if the problem is from your samples or the antibody.
  3. Change the antibody---they will send you another one for FREE, why not call them? ps, you can also ask the custom service for some advice.

• nikun230 (2014-3-20 22:42:15)

  
  In addition, I used to have trouble with Santa Cruz antibody, I am not sure if "lower the antibody concentration" is true or not, in most of my case, I need to increase the primary antibody concentration (to 1:200) and decrease the secondary antibody to get very good bands.

• gogo (2014-3-20 22:42:37)

  1. 二抗浓度过高可引起背景深、一加发光液就看到整张膜很亮（消耗底物快），进而出现阴性结果，可适当稀释二抗浓度；室温1h；
  2. 一抗可定在1：1000左右，室温2h。过高不但背景深、易出现阴性结果；
  3. 牛奶封闭4度过夜或室温3h以上，以减少背景；
  4. 化学发光最好用fg级；
  5. 根据你的目的蛋白长度可调整转膜电流；或根据actin的亮度调整上样量。

• 婴儿脸 (2014-3-20 22:42:59)

  
  洗膜洗得是不是不够干净？

• leifengta (2014-3-20 22:43:37)

  
  你洗多长时间？几次？

• 婴儿脸 (2014-3-20 22:44:02)

  QUOTE:

  原帖由 leifengta 于 2014-3-20 22:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  你洗多长时间？几次？

  我洗3次，每次8~10 min，第一次放在摇床上。
  用的是碧云天的Western洗涤液，是不是一般都用TBST？

• leifengta (2014-3-20 22:44:36)

  一抗孵育后用PBST洗4次，在二抗孵育后用用PBST洗4次和PBS洗1次。每次均为10min

• 婴儿脸 (2014-3-20 22:45:21)

  谢谢
  PBST是PBS加了Tween20吗？TBST可以吗？