【求助】反转录时该选用oligo dT还是 随机6引物？

最新回复

• zzzz (2015-7-02 16:48:23)

  
  一般情况简单地说你的目的mRNA有playA尾，且基因较小2000bp以内吧都可以选择oligo dT；但如果你的目的mRNA没有playA尾或者你的基因较大时，由于RT酶的扩增能力问题就要用随机引物啦。

• one (2015-7-02 16:48:40)

  
  楼上正解，还有如果您希望得到全长的CDNA，就应该选用oligo dT。再有调取特异片段的时候反转录还可以使用下游特异性引物的。

• JK.jon (2015-7-02 16:49:53)

  
  oligo(dt)与哺乳动物mRNA的3‘端ploy（A）尾巴序列互补，其特异性要比随机引物高；但随机引物能与mRNA中许多位点互补，当mRNA序列很长或者包含许多二级结构时候建议用随机引物。

• dior (2015-7-02 16:50:12)

  
  去听了一个公司的专业讲座（公司名字就不说了，以免有广告之嫌），讲的是定量PCR的“标准”。其中有建议说，定量PCR之前的RNA逆转录过程中，最好将Oligo-dT和随机引物混合使用，会提高逆转录的效率，也使结果更加客观和稳定。原理很简单，RNA提取过程中可能有部分RNA轻微降解，无PolyA 尾。还有一些基因的mRNA很长，有随机引物的掺入，会加大扩增出全长的效率。两种引物各有优缺点，因此，混用可以取二者之长。

• ztonyc (2015-7-02 16:50:29)

  
  楼上可以详细的讲讲吗？第一次听说，谢谢。

• baidukk (2015-7-02 16:50:57)

  
  也是第一次听说二者混用，不过听起来很有道理，有没有具体的资料？

• yes4 (2015-7-02 16:51:23)

  
  是公司内部研发的资料中的，是讲荧光定量PCR国际化标准（MIQE）的讲义。中间提到的前期关于RNA逆转录过程的要点。整个讲义主要是基于下面这篇英文文章（下面会附上）。但我看了一遍，里面没有直接提到我上面提到的。因此，我把我拿到的讲义上面的话抄下来：
  “在反转录步骤中，关键的是抽提的RNA样品能够连贯完整的基因组。一些基因长度很长，但这些序列的RT产物长度不足，特别是在RT引物只是和每个mRNA末端配对时。使用mRNA末端配对引物和mRNA序列随机位点配对引物的组合会得到每个基因的反转录产物群。此方法比单一的末端或随机位点配对转录本更具有代表性，可对转录基因组进行更好的覆盖。”
  此观点没有提供来源出处，仅供大家参考

• cbou876 (2015-7-02 16:51:52)

  关键的量的问题没有提到啊，是不两个引物各加原来的一般就行还是加原量。！！！

• nn255 (2015-7-02 16:52:09)

  
  提供一个产品说明书中的反应液配制吧：
  5×PrimeScript Buffer 2.0ul
  Random 6 mers(100uM) 0.5ul
  PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5ul
  Oligo dT Primer(50uM) 0.5ul
  Total RNA ×ul
  RNase Free dH2O up to 10ul
  Total 10ul
  10ul的反应体积最大使用500ng的Total RNA。
  但是我做逆转录10ul体系，加入1000ng的RNA也OK。

• ero11 (2015-7-02 16:52:30)

  我们实验室也是连个混合起来用的，反转录效率的确会提高。

• dog002 (2015-7-02 16:52:48)

  第一次听说可以混着用，学习了

• vvmmoy (2015-7-02 16:53:11)

  
  在下认为，随机引物会增加cDNA的量，而oligodT相对来说，比较完整的保留了cDNA的基础含量。在定量的时候，oligodT所得到的结果要比随机引物精确一些。

• jude (2015-7-02 16:53:34)

  目的基因有10kb，用oligo dt逆转录，进行PCR可行吗？

• cbou876 (2015-7-02 16:53:54)

  
  这个问题极好，受益了。个人认为，两种引物混用是最佳选择，因为这就是一个机率问题，重要的是保证所有样本都采用同样的方法处理，方可进行比较；而不同文章采用不同方法，比较起来就要慎重了。

• wawa (2015-7-02 16:54:12)

  
  我讲得比较通俗一点，是土方法，不知道专不专业，我是凡是RNA结构比较完整，比如是新鲜组织的RNA，就用oligo dT，而像石蜡组织提的RNA，结构破碎，就用随机引物。

• wu11998866 (2015-7-02 17:00:49)

  
  我们试剂盒上的说明书就写着随机引物和oligo dt一起用

• milkdog (2015-7-02 17:01:11)

  目的基因有10kb，用oligo dt逆转录，进行PCR可行吗？

• remonte (2015-7-02 17:02:57)

  
  clontech有一个盒子，据说如果是哺乳动物RNA的话，可以合成0.5-10kb的cDNA,你有兴趣可以了解一下啊。

• luoliqiong (2015-7-02 17:04:03)

  
  新手，问个问题，随机引物怎么弄的？

• bring (2015-7-02 17:04:19)

  
  随机引物一般为六个或者九个碱基。每个碱基都有可能是四种碱基中的一种。这样6个碱基的就有4^6之多的组合，9个碱基的更多。就是这样合成的。