【求助】请教western blot膜再生strip的原理

最新回复

• tie8 (2014-2-13 17:43:36)

  
  使用stripping buffer 可以去除一抗和二抗，然后可以重新利用膜。
  我用stripping buffer之后还是做同一种抗体，
  只不过根据ECL效果调整抗体浓度。
  和重新跑胶、转膜相比，呵呵，能节省点时间。
  由于重复使用，蛋白信号会有一定减弱，所以我一般用三次，感觉还可以。
  网上很多配方，可以自己配的。
  祝一切顺利！

• fei1226com (2014-2-13 17:43:58)

  
  我这里有配方，但是STRIP以后，发现效果不是很好，所以，我干脆多转几次算了

• tie8 (2014-2-13 17:44:35)

  想请教一下大家，strip液作用的原理是什么？是否能将一张膜再生后做同一种抗体的western blot呢？刚开始做WB，请大家多多帮忙。谢谢！
  
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  1。stripping buffer 含有适量的sds，在低ph值或适当的温度下，可以使膜上的大多数抗原抗体复合物分开。
  2。完全可以用同一种抗体再杂交一次。
  我的经验是同一张膜stipping3次就差不多了，而且用同一种一抗，信号强度是一次比一次递减的。

• douding66 (2014-2-13 17:45:01)

  
  strip的配方有多种，不同的配方，strip的原理都不太相同。但是目的都只有一个，那就是使膜上的抗原抗体复合物分开。

• standbyme (2014-2-13 17:45:31)

  
  Stripping Buffer:β-mercaptoethanol 342 μl；20% SDS 5 ml；1M Tris-Cl pH 6.7 3.125 ml；加ddH2O至 50 ml。
  方法：将用过的膜浸入stripping buffer中，置50℃水浴箱中30min，间断振摇。之后用TTBS洗3*5min就好。此时你已经可以按新的转移好的膜来再次使用了。

• 101010 (2014-2-13 17:45:53)

  为什么非要stripping呢，如果你的检测蛋白不在同一个分子量范围内,把膜直接用与另外一个抗体的检测就可以了，没必要做stripping了.
  另外,stripping一般都不完全,含SDS的强stripping配方容易造成膜上蛋白丢失,一般推荐使用中度强度的低pH Glycine,可加热的配方.

• abc816 (2014-2-13 17:46:23)

  
  为什么非要stripping呢，如果你的检测蛋白不在同一个分子量范围内,把膜直接用与另外一个抗体的检测就可以了，没必要做stripping了.
  请问zebrafishtom：
  直接用是什么意思？用蒸馏水把ECL洗掉，然后直接与另一种一抗孵育？
  或者 与一种抗体孵育后，再与另一种抗体孵育，最后一起显色？
  我正在考虑运作方式：对于几种单克隆一抗，其抗原蛋白的分子量不同，能否一一孵育，最后一起ECL显色，检测？有人尝试过吗？

• lixi559 (2014-2-13 17:46:47)

  
  如果你的蛋白分子量相差较大，可以直接用TBST洗膜，3次*10min，然后就封闭，孵育一抗和二抗，后面的步骤都一样的，效果不错，我们做过。

• 66+77 (2014-2-13 17:47:23)

  为什么非要stripping呢，如果你的检测蛋白不在同一个分子量范围内,把膜直接用与另外一个抗体的检测就可以了，没必要做stripping了.
  请问zebrafishtom：
  直接用是什么意思？用蒸馏水把ECL洗掉，然后直接与另一种一抗孵育？
  或者 与一种抗体孵育后，再与另一种抗体孵育，最后一起显色？
  我正在考虑运作方式：对于几种单克隆一抗，其抗原蛋白的分子量不同，能否一一孵育，最后一起ECL显色，检测？有人尝试过吗？
  
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  呵呵,楼上的意思是如果抗原分子量不同,可以根据预染MARKER分别剪开,分别孵育,(虽然预染MARKER不太准,但是基本差不多,可以多剪一些),最后ECL显色，检测
  GOOD LUCK

• abc816 (2014-2-13 17:47:46)

  
  如果要检测A和B两个蛋白,两个的MW假设为A=43kD, B=55kD
  A为高丰度蛋白,B为低丰度蛋白. 如果根据prestained marker来剪的话经常容易切错.
  所以我的推荐的做法是不切开.
  第一次IB,先做低丰度的B蛋白,做完以后(确保PVDF膜湿润,如果在暴光中膜干了，用甲醇重新浸泡以确保湿润)可以直接做后面的A蛋白.或者更保险的方法(将膜TBS或封闭液中4度过夜,或者用0.1MGlycine-HCl,pH2.2处理15-30min后再重新封闭进行下一轮的I

• flower-201 (2014-2-13 17:48:12)

  
  strip一般会造成附着在膜上的抗原损失较多，定性的话倒没多大影响，如果定量的实验，最好重新转膜后再抗体孵育。

• DONT (2014-2-13 17:48:29)

  
  我用的是PH2.5的1XGlycine,效果挺好的

• abc816 (2014-2-13 17:48:49)

  
  我没有用过strip,都是跑两块胶

• zwsyrt (2014-2-13 17:49:24)

  
  按marker把膜剪开了，先分别孵育两个抗体
  晚上显影后，再strip
  孵育另外两个抗体，
  能不能出来看明天的了