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【求助】引物非特异严重

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2015-1-07 15:14    作者: jebel    来源: 分析测试百科网

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【求助】引物非特异严重
前辈们，大家好，我是RT-pcr的新手，这是我的琼脂糖凝胶电泳图。上面的亮带是我的目的条带，可每个泳道的目的条带下面的条带是不是非特异条带呀？如何降低非特异条带呢？？有经验的大家给我出出建议，先谢谢大家。(*^__^*) ……
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  • qqq111 (2015-1-07 15:15:15)

    提高退火温度试一下！

  • dragonkilly (2015-1-07 15:15:33)

    这是RT的结果吗？用的是不是随机引物啊？

  • mamamiya (2015-1-07 15:15:54)


    稍往上加点退火温度试一试。

  • 3648755 (2015-1-07 15:16:09)


    这个影响因素很多的
    可能是引物设计有问题 设计原则可以在网上找到的
    也可能是退火温度的影响 温度越高 特异性越强
    另外各种试剂一定不要混用 以免污染

  • jebel (2015-1-07 15:16:46)

    这是RT的结果吗？用的是不是随机引物啊？

    ===================================================================

    是呀。这个是RT-PCR产物的电泳图。反转录所用的不是随机引物，是我设计的下游引物。

  • jebel (2015-1-07 15:17:02)

    QUOTE:

    原帖由 mamamiya 于 2015-1-7 15:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    稍往上加点退火温度试一试。
    好的，谢谢学长学姐们的指导，我现在使用的退火温度是55度，我提高些试试。还有，想请教设置退火温度是自己算Tm值？还是直接看TARAKA公司的引物合成单子的Tm值呢？？最佳退火温度是Tm-5度是吗？

  • jebel (2015-1-07 15:17:22)

    QUOTE:

    原帖由 3648755 于 2015-1-7 15:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    这个影响因素很多的
    可能是引物设计有问题 设计原则可以在网上找到的
    也可能是退火温度的影响 温度越高 特异性越强
    另外各种试剂一定不要混用 以免污染 ...
    谢谢前辈给指出的多方面影响因素，谢谢，现在我还是想在现有引物的基础上，想办法减少非特异产物的条带。

  • free (2015-1-07 15:17:54)

    QUOTE:

    原帖由 jebel 于 2015-1-7 15:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    谢谢前辈给指出的多方面影响因素，谢谢，现在我还是想在现有引物的基础上，想办法减少非特异产物的条带。
    建议做个梯度 比标准Tm值低五℃左右 应该能得到很好的结果 但是如果还是没有消除杂带 我建议更换引物···要不就切胶回收了

  • jebel (2015-1-07 15:18:12)

    QUOTE:

    原帖由 free 于 2015-1-7 15:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    建议做个梯度 比标准Tm值低五℃左右 应该能得到很好的结果 但是如果还是没有消除杂带 我建议更换引物···要不就切胶回收了
    嗯 谢谢你 学长。会不会是PCR现有体系不好，即便做了退火温度梯度（55-63度）也有非特异性扩增。一直以来，没有优化过体系。您能该我些优化体系方面的建议吗？？

  • free (2015-1-07 15:19:20)

    QUOTE:

    原帖由 jebel 于 2015-1-7 15:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    嗯 谢谢你 学长。会不会是PCR现有体系不好，即便做了退火温度梯度（55-63度）也有非特异性扩增。一直以来，没有优化过体系。您能该我些优化体系方面的建议吗？？ ...
    也有可能 但是要改变PCR体系比较困难 因为这涉及到实验的标准化与重复性 你用的是什么体系 是哪家的试剂盒 还有你的目标条带的特性等等···你说的详细些 说不定有高手能帮到你

  • jebel (2015-1-07 15:19:55)

    请前辈们进来看看：引物非特异现象严重。
    cuturl('http://bbs.bbioo.com/forum.php?m') ... &fromuid=328496]请前辈们进来看看：引物非特异现象严重。 cuturl('http://bbs.bbioo.com/forum.php?m') ... &fromuid=328496[/url]
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