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【讨论帖】microRNA内参，u6,u6a,u6b，到底如何选择
我的做法是先逆转录再荧光定量pcr！【讨论帖】microRNA内参，u6,u6a,u6b，到底如何选择
逆转录使用特异性引物（u6的反向引物）。
u6，also as know RNU6A,RNU6B，分别对应 RNU6-1，RNU6-2，
U6 F CTCGCTTCGGCAGCACA
U6 R AACGCTTCACGAATTTGCGT
这个引物是在google学术搜索里面检索出来文献最多的，有多篇cancer reserach高影响因子使用，且经丁香园内朋友使用，反应很好！
在生工合成的，今天pcr结果非常好！U6的ct 13.1左右。
另外，多谢园友提醒，这些u6都是用于人的。不清楚，也没有验证是否可以用于老鼠！
希望能够给大家一点帮助。
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园丁## (2015-6-01 15:07:28)
后记：U6 F CTCGCTTCGGCAGCACAU6 R AACGCTTCACGAATTTGCGT这个引物是在google学术搜索里面检索出来文献最多的，有多篇cancer reserach高影响因子使用，所以在没有人回答的情况下，选择了这个。在生工合成的，今天pcr结果非常好！U6的ct 13.1左右。不知道别的U6引物实验结果怎么样，但是我可以证明，这个用着很好！希望能够给大家一点帮助。对你有帮助的话，请投票支持！
园丁## (2015-6-01 15:08:45)
U6 F CTCGCTTCGGCAGCACA
U6 R AACGCTTCACGAATTTGCGT
这个引物是在google学术搜索里面检索出来文献最多的，有多篇cancer reserach高影响因子使用，所以在没有人回答的情况下，选择了这个。
在生工合成的，今天pcr结果非常好！U6的ct 13.1左右。
不知道别的U6引物实验结果怎么样，但是我可以证明，这个用着很好！
希望能够给大家一点帮助。
JK.jon (2015-6-01 15:18:59)
我刚开始做micro-rna，也不知用什么引物？本来打算直接买U6的试剂盒，可是挺贵的，
谢谢楼主的提供，先合成试试.谢谢了，那请问楼主是用的TAKARA的RT-PCR试剂盒吗？
谢谢了，急需！
S6044 (2015-6-01 15:19:27)
请问一下楼主：你的U6是人的还是什么物种的？包括了探针序列吗？
chengjie79 (2015-6-01 15:22:11)
楼主好，我现在也要准备做血浆的MICROrna,不知道 楼主用什么方法提的microRNA,用的什么试剂盒，推荐一下，谢谢!
shenkunjie (2015-6-01 15:22:30)
需要合成茎环RT引物吗？
园丁## (2015-6-01 15:23:00)
QUOTE:
u6的rt引物，就是pcr时的反向引物。不需要颈环的！
园丁## (2015-6-01 15:24:52)
就是进行特异性逆转录！
am10 (2015-6-01 15:25:34)
我用的是u6的内参，但是RT和pcr的盒子都用的是AB家的，还有想问，如果是做血浆的microRNA和做血清的，有什么差别呢？
dior (2015-6-01 15:26:17)
我们做组织及细胞的microRNA用的U6，做血浆/血清的miRNA的内参文献报道各家不一，大多是用的syn-cel-miR-39 spike-in control, miR-16，极少数用U6，还有用总RNA量或体积做内参的。目前针对血液miRNA仍无有效的内参，正在研究中。
xevin (2015-6-01 15:46:02)
谢谢楼主的提供，先合成试试.谢谢了，那请问楼主是用的TAKARA的RT-PCR试剂盒吗？
谢谢了，急需！
以前做过一点，原先是做RNAi的shRNA，做完后，老板对microRNA兴趣，买了试剂盒让我做。哈，很方便，那时的老板舍得烧钱啊
S6044 (2015-6-01 15:49:24)
october7 (2015-6-01 15:50:02)
2541 (2015-6-01 15:54:31)
亲爱的楼主你好：
非常感谢你分享U6的引物序列！对我来说简直就是救命稻草！我现在在做的是检测H19 mRNA到底是在细胞核还是细胞质里，需要分离细胞核细胞质提取RNA，然后做Q-PCR检测H19的量，细胞质中可选的内参有很多，比如所Actin或是GAPDH，细胞核目前选择的是U6，所以要查找U6的序列设计上下游引物，用下游引物做RT，然后做Q-PCR。我都找了2天了，都没找到全长的U6，只在文献中查到27-100碱基的序列，楼主的分享很给力！但是我还是想知道人U6的序列是多少？希望楼主可以告诉，非常感谢的说！
2541 (2015-6-01 15:54:48)
U6 R AACGCTTCACGAATTTGCGT
这个引物是在google学术搜索里面检索出来文献最多的，有多篇cancer reserach高影响因子使用，所以在没有人回答的情况下，选择了这个。
在生工合成的，今天pcr结果非常好！U6的ct 13.1左右。
不知道别的U6引物实验结果怎么样，但是我可以证明，这个用着很好！
希望能够给大家一点帮助。
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我想请问下楼主：包含U6引物序列的文献怎么查找，特别是“cancer reserach高影响因子”的，希望楼主方便的话给我提供几篇，我好作为依据！非常感谢的说！
园丁## (2015-6-01 15:55:09)
u6的序列可以在ncbi里面找，
cancer res的高影响因子的文章可以在google学术里面找关键字:u6 primer mirna 高级搜索的杂志名：cancer res
园丁## (2015-6-01 15:57:09)
不好意思，我做的细胞，没有做血清，没有发言权。
但是或许可以类推吧！
zhy平平 (2015-6-01 15:58:28)
QUOTE:
灰常感谢LZ的回答~目前我遇到一个新的问题想向你请教！1. 我的实验背景之前已经说了是检测细胞质和细胞核中H19的表达~所以我设了3个组，总cell，cell质，cell核，总cell要设GAPDH和U6的内参，cell质GAPDH，cell核U6，还是每个都设2个捏？
2.我分别提总RNA后做反转录是一个一个体系(PCR)中同时加入oligo(dT)和U6-R进行反转录还是平均分两管分别加oligo(dT)和U6-R进行反转录？
3.2中的两种转录方法我都试过~可是奇怪的是我做Q-PCR的时候U6的CT并不像LZ之前所说的在13.1作用，我一U6CT值竟然在5.6.7作用。会不会太小了啊？可是我做H19和GAPDH都在20-25作用很正常！难道U6对Q-PCR另有要求？
不解中。。。。求LZ不吝赐教~
园丁## (2015-6-01 16:01:26)
不好意思，因知识所限，第一个问题无法回答。
第二个问题，我当时也考虑过对u6,是进行特异性的反转录（用u6-r），还是用oligo(dT）常规扩增，后来选了只用u6-r做。考虑到既然mirna用了特异性的引物，u6也用特异性的，更具有可比性。
第三个问题，你提取mRNA的试剂是trizol？还是过柱子纯化miRNA？
u6的ct值问题，根据你逆转录时加入的量有关，我做过9，但是5.6.7没有做过。
1、你得实验组和对照组u6ct值一直很稳定，都是5.6.7？
上面你回答是，那么加上你的u6溶解曲线是狭窄的单峰，估计你得结果没有问题！
1221 (2015-6-01 16:01:52)
miRNA基因表达水平常用的方法是荧光定量PCR，而荧光定量PCR实验中，起始样本量，样本收集，RNA制备和定量，反转录效率的差异都可能导致定量的错误。内源性对照基因是目前纠正初始样本量，RT效率的最准确的方法。
small nuclear RNA (snRNA)和small nucleolar RNA (snoRNA)长度与miRNA相近，200bp左右，在多种组织细胞中高表达，不涉及miRNA的调节途径，且与miRNA探针设计方法相同，所以snoRNA是很好的内参选择。研究证实常用的snoRNA assays包括
Human: U6, RNU48, RNU44, U47, and RNU6B
Mouse: snoRNA-202, snoRNA-234, snoRNA-420
还有一类是在不同实验条件下变化差异很小的miRNA
Human/mouse tissues: miR-152, -186, -25, -92, -26b, -16
Human/mouse cell lines: miR-374, -16, -93, -186, -26b, -92 1
还有一类是传统沿用的
18S rRNA or U6
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