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【求助】丙酮沉淀的困惑！
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丙酮沉淀都说会丢失蛋白质，可是还有这么多人用沉淀法！
1、到底会丢失多少蛋白质？？
2、为什么会丢失？？？
3、尿素和其他裂解液的成分溶于丙酮吗？？如果跟着沉淀下来，会不会影响上样液中各种成分的浓度，进而影响聚焦？
4、丙酮风干不充分，会影响IEF聚焦吗？？
5、一般你们沉淀多久？？？最少多久？？？
6、丙酮沉淀真的可以去除离子吗？我的标本同样沉淀，为什么有时电压上不去有时上的去？
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最新回复
NBA (2013-6-19 14:10:17)
1,肯定会丢失蛋白质,具体丢多少取决于样品的种类.
2,有些蛋白质一经沉淀之后难以再溶解.
3,应该不会跟着沉淀下来,至少绝大部分不会.
4,一般5分钟风干足够了,尽量充分.
5,最少2小时以上以沉淀完全,减少丢失的蛋白质。偶常用沉淀过夜。
６，可去除大部分离子，但还有一小部分会跟着沉淀。
uuooii (2013-6-19 14:10:38)
感谢。
您的丙酮中加DTT吗？有必要吗？？
NBA (2013-6-19 14:11:00)
QUOTE:
您的问题有难度啊。偶的建议仅供参考，具体还需要您自己摸索。
丙酮中可以加ＤＴＴ，也可以不加。
kuaizige (2013-6-19 14:11:29)
windy+++ (2013-6-19 14:11:48)
我用丙酮沉淀发酵液的蛋白质，发酵液含有磷酸盐缓存液，用丙酮沉淀后盐含量很高。我做了一个对照试验，将丙酮直接加在一定浓度磷酸盐缓存液中，明显看到白色的沉淀，我感觉丙酮的去盐不好。
qumm1985 (2013-6-19 14:12:20)
Amersham的clean-up kit也是TCA和丙酮，但还有其它的。斑竹或那位知道它有哪些啊？？？？？（kit好贵啊)
NBA (2013-6-19 14:12:44)
QUOTE:
您是指KIT的配方吗,不好意思,偶知道的和您一样多,呵呵.uuooii (2013-6-19 14:13:18)
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谢谢你，我也是因为有些怀疑这个才发帖子的。你都用盐溶液试过了，事实胜于雄辩，看来去盐最多只是一部分。
根据你的提示，回头我试试向裂解液中加丙酮，看看尿素等会不会沉淀下来。
另外，丙酮不是夺取水分，蛋白才会沉淀下来吗？？所以溶于水的成分必然会沉淀下来。这是我的理论上的推测。（供大家讨论丙酮沉淀的原理）
另外我还觉得，如果裂解液的成分跟着沉淀下来，会影响上样液中各种成分的浓度，进而影响聚焦。
所以我觉得沉淀应该考虑裂解液的成分和浓度。（个人观点，供大家讨论）
uuooii (2013-6-19 14:14:22)
大家继续讨论，TCA/丙酮沉淀和单独丙酮沉淀的比较。
原理，各自特点，以及沉淀过程中注意的问题。
uuooii (2013-6-19 14:14:42)
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对溶解性有好处？？表达不太清楚吧？？沉淀的目的是使蛋白尽量沉淀下来，“对溶解性有好处”干嘛？我想大虾的意思可能是对沉淀后蛋白的再溶解有好处。
纠正表述不清，避免误解，建议主任加分。
另外，再溶解时上样液中一般不是有DTT吗？？丙酮中加DTT到底干什么用？？大家讨论。
uuooii (2013-6-19 14:15:00)
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一点建议，不知是否正确，是否对你有用：用超纯水稀释一下溶液，多分装几管，分别沉淀，上样时可以再合并，或许对尽量去除盐有好处。
因为我感觉：是不是盐达到一定浓度之后，再沉淀时，下来的会多。（是否这样？大家讨论，最好是有化学方面专家参与讨论）
yychen (2013-6-19 14:15:25)
有盐的样品其实用丙酮淀肯定盐也会沉淀下来的，这取决于盐的浓度和蛋白的浓度，理论上蛋白的浓度越高，沉淀损失也越少，而且沉淀的时候最好在低温进行，可以避免蛋白的沉淀，沉淀后也尽快去除丙酮，这样也可以避免蛋白的变性。其实同样条件下也可以用乙醇沉淀，乙醇极性大点，这样可以盐的溶解度也大点，其实不同蛋白其实溶解也不同，例如脂溶性蛋白在有机溶剂中倒溶解得更好，我觉得要想做好电泳，那还是透析或者凝胶过滤除盐后再浓缩，这样保险点。
NBA (2013-6-19 14:15:52)
对于这个沉淀的问题,偶发表一下个人的观点:丙酮沉淀可以去除一部分盐,在2-D电泳中具体表现为:在IEF中使用丙酮沉淀后离子浓度大大降低,电压更容易上去.在丙酮中添加DTT的作用准确说应该是防止二硫键之形成,进而防止蛋白质聚合物的形成(蛋白质聚合物的形式是多样的,肽段内\肽段间等等都可能,这也是形成steak的一个重要原因).另外色谱兄所说的丙酮使蛋白质变性具体的表现形式是什么?机制,最好能有根据(书或文献),辛苦色谱兄了.此外，ＩＩＥＦ缓冲液中的蛋白质本来不就是变性的吗？这里所指的变性和丙酮作用的变性是否形式相同，请教大家。另外色谱兄最后一句话说到点子上了，最perfect的办法莫过于dialysis了（也是诸多分析化学家推荐的除盐的终极办法）！大家在平安夜还战斗在蛋白质技术版面的第一线，在此对各位对本版面的支持深表谢意
INK (2013-6-19 14:16:13)
凝胶过滤除盐比较麻烦，透析除盐效果有没有简单的判断标准？增加换液次数，透析时间能保证除盐彻底吗？
idoww (2013-6-19 14:16:54)
NBA (2013-6-19 14:17:21)
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TCA／丙酮沉淀损失的蛋白是比较多，而且蛋白质比较难重新溶解
qumm1985 (2013-6-19 14:18:04)
guagua (2013-6-19 14:18:23)
采用三氯乙酸/丙酮沉淀蛋白质的方法不错，沉淀在4摄氏度冰箱里面进行，最后丙酮要去除干净，否则会影响电泳，可以采用旋转真空干燥，或者用电吹风吹干即可
uuooii (2013-6-19 14:19:57)
丙酮为什么会影响2D？
真空干燥没有，电吹风要吹多久？我一般超净台风干半小时。
yes4 (2013-6-19 14:20:36)
0.8ml的样品+0.36ml 1M三氯乙酸，4摄氏度放置10-20分钟，如果效果明显，可以看到絮状沉淀，然后离心，5000rpm，5-10min，时间具体自己掌握，只要沉淀离心下来就好，加1ml丙酮清洗沉淀，除去多余的三氯乙酸，然后干燥，如果觉得沉淀的蛋白不够，可以在加丙酮之前，重复三氯乙酸沉淀步骤。电吹风不需要太长时间，你可以看到沉淀蛋白的颜色变化，其变成粉末状就可以了
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