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【求助】Western条带有竖纹、杂点多
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同时做2块胶,一块做b-actin、一块做目的蛋白(23kd)。条件如下:
15V半干转膜30min,37度封闭2.5h,
actin:一抗(sc-7210)1:500,4度过夜,二抗1:10000室温2h,ECL显色;
目的蛋白:一抗1:500,4度过夜,二抗1:2000室温2h,ECL显色。
结果:
目的蛋白条带很清晰,而actin条带上有很多毛毛糙糙的竖纹,整个胶片上有很多斑点。重复了2次,都是这个结果。
分析:
应该不是封闭牛奶的原因,因目的条带很干净。我估计可能是一抗的原因,应该怎么改进,请高手多多指教!
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最新回复
ladyhuahua (2014-4-18 16:36:05)
actin条带是不是非常强,如果是的话应该是一抗浓度过高的原因,建议降低到1:1500试试;
如果actin条带不强又脏的话,怀疑抗体有问题.建议封闭的时间再长点,可以4度过夜.用5%的封闭液稀释抗体;同时延长过夜时间,以增加特异性结合,减少非特异性结合.
希望对你有帮助!
yhz1973 (2014-4-18 16:36:25)
抗体是新定的santa cruz国外原装的actin(H-196),SC-7210.
如果是抗体有问题的话就亏大了,
我再重新做一次,有好消息了通知大家。
remenb (2014-4-18 16:38:05)
根据我的实验经验有以下几种可能:
1.配的浓缩胶胶孔中有碎胶块,建议:上样前用去离子水冲洗胶孔
2.处理后的样品中有沉淀或不溶物,建议:上样前12000G离心1MIN,小心吸取上清,勿吸入沉淀
3.一抗特异性较差,建议:5%Milk封闭4度过夜,漂洗条件6个8MIN
4.二抗1:3000稀释,建议:5%Milk封闭室温1小时,漂洗条件8个8MIN
这些都是我平时的实验经验,希望对你有帮助!祝实验顺利!
yhz1973 (2014-4-18 16:38:22)
谢谢各位!
向大家汇报一下结果:就是国外原装抗体出了问题!
换了抗体以后,条带就很漂亮了!
ritou1985 (2014-4-18 16:39:28)
我补充:1.跑胶时缓冲液(包括跑胶缓冲液和上样缓冲液不合适都可以造成这种结果)
2.是制备的样品不好、
3.封闭的问题(比如,封闭液中有与你一抗非特异结合的成分,也就是一抗的问题)
4.转印液和电泳液一定要用新鲜配制的
kuohao17 (2014-4-18 16:42:13)
向大家汇报一下结果:就是国外原装抗体出了问题!
换了抗体以后,条带就很漂亮了!
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感谢楼主反馈信息,能否将换抗体前后两次实验结果对比图贴一下,再分析一下是否确实是抗体的问题?谢谢您的支持!
BOSS2011 (2014-4-18 16:43:09)
不相信?!
你可以不做印迹,直接将电泳后的胶染色,条带也是有竖纹的.
楼上所说的样品中有不溶物,可能也会引起竖纹,
但是我有好几次遇到竖纹,后来发现是loading buffer的问题,因为不单样品有竖纹,marker的条带也有竖纹,预染MARKER嘛,电泳时可以直接看到条带的竖纹.
换了loading buffer就好了.
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