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质谱沙龙第十一期活动报道

2008.9.05

2008年8月31日下午，质谱沙龙第十一期活动在西苑医院实验楼举行。会议有来自二炮总医院、西苑医院、医科院药物所、医科院药植所、朝阳医院、北大医学院、北医三院、空军总医院、中科院过程工程所、AB公司等老朋友，还有来自中科院、中科院微生物研究所、艾杰尔科技公司等新朋友。

应大家要求，AB公司首先请出有几十年质谱、色谱分析经验的高级应用工程师赵贵平老师，总结质谱分析的经验，并现场为大家答疑解惑。赵贵平老师以前在北京化工大学工作，从80年代开始就从事各种分析检测、尤其是质谱的分析工作。加盟公司以来，有着深厚质谱背景的赵老师，凭借丰富的实际经验、严谨的工作态度、为用户服务、钻研新方法的精神，帮助用户开发了很多前沿的方法，解决了用户很多应用的难题，获得了众多用户的好评。要想把液质联用各种复杂的实际问题和经验解决办法，浓缩在这么短的时间里是非常不易的。赵老师从ESI的最基本原理讲起，主要介绍液质联用遇到的常见问题，并边讲边回答大家的问题。

这里撷取一些要点总结：

（1）理解电喷雾原理：ESI在溶液中电离，而APCI是在气相中电离，样品的性质不同就会产生不同的电离效果。那什么样的物质可在溶液中电离？一般笼统以极性、非极性区分，广义上采用路易斯酸/碱的定义，比如含有N原子、-COOH、-OH基团的化合物，通常ESI会电离。

（2）为什么要用梯度？有些用户为节省时间，液质联用喜用短柱、等度。但赵老师还是建议：不管是作单一的还是多个化合物的分析，液质联用尽量用梯度洗脱，一来可以使质谱峰形更窄、灵敏度更高；更重要的是可以降低成本：比如对一根新色谱柱，走等度可走1000针；而梯度可以到2000针。梯度方法里，柱子被清洗得更干净。

（3）液质联用和液相的流速不同。ESI最佳流速为0.2～0.5 mL/min，很多情况下超过0.5 mL/min离子源腔体会结雾，这和色谱的常用流速不同，在选柱子方面也要考虑；现在很多公司也专门出了适用于质谱的色谱柱/窄径柱，如2.1×50×150 mm。在这里还特别指出AB公司在离子源设计方面、有利于大流速分析的特点，因为AB公司的TurboV™离子源有ZL的两路辅助雾化气，可以在大流速下仍快速地去溶剂。

（4）如何选择母离子：大家很多人在一级质谱中见到的M+H⁺或M+Na⁺（注：下文中M+K⁺和M+Na⁺情况相同），有时M+Na⁺峰强度要高于M+H⁺峰，有些用户干脆选择更强的M+Na⁺峰做二级质谱，却会常遇到找不到子离子的烦恼，比如子离子峰不稳定或灵敏度太差。80%的样品找不到M+Na⁺峰的子离子，而M+H⁺峰一般都能找到很稳定的子离子，峰也很漂亮。只有很少的一些结构可以使用M+Na⁺峰做二级质谱。这其中的原因，赵老师说他自己这一段也在研究和探索规律。

有时，M+H⁺或M+Na⁺峰的子离子都有，也建议大家尽量选择M+H⁺，因为，M+Na⁺峰的子离子虽然在直接进样的时候可以看到，但在做LC-MS时一般不稳定，比如硝基呋喃的AOZ代谢物，直接进样M+Na⁺峰远高于M+H⁺，但若选M+Na⁺，二级质谱极不稳定，无法定量；而选择M+H⁺做二级质谱就很好。当然，也有特例的情况：比如，阿维菌素的于M+H⁺或M+Na⁺，做二级质谱都挺好。

因此建议，只要能用M+H⁺的尽量用M+H⁺，M+H⁺若实在做不好，再去尝试一下M+Na⁺。

（5）如何去除Na⁺：接着上面的问题，就有用户问，很多蛋白/多肽，如何去除Na⁺。建议的有效方法是过反渗透膜（透析），把Na⁺置换掉；懒一点的方法是加甲酸，比如100 uL的移液管滴一滴甲酸到样品瓶中。这样pH大概在2左右，一般都会获得较好的效果。有时，也可以在柱后进质谱离子源之前，通过三通柱后添加一些酸。（注对比：0.3%的甲酸，pH约为1.9；0.1%的甲酸，pH约为3。）

（6）不要只图一次痛快：有些用户为了追求色谱保留，在液质联用时，非要加三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸等。这样也许当时做得高兴了，但仪器会被彻底地污染，做完后会有无穷无尽的残留，怎么洗也洗不掉，只能等工程师来拆仪器洗了。赵老师举了两个生动的例子，再次警示大家要注意。有个用户做氨基糖，色谱没保留，查文献要加1%七氟丁酸，做之前就问，赵老师就提醒他这样不行，以后别人想做负离子就没法用了。但为了自己的课题，那个用户还是冒险用了，用完后负谱就已经全是七氟丁酸的169，本底溶剂都看不见了。还有个用户也是冒险用，做完了，再想做氯霉素负离子，就彻底不行了。所以，这样的情况，真的劝大家不要去尝试，不行就放弃这个实验算了。不能为了一时痛快把整台仪器污染了。

还有用户问三乙胺的问题，赵老师的回答比较幽默：“也能用，就看你忍受不忍受得了。”三乙胺出峰是m/z 102，如果每次都只做m/z 150以上的，就没问题，但如果想看100以内的低分子量区的谱，就全是102。相比来说，三乙胺表现还“仁慈”一点：一周后102还会下去一些；但若是三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸，仪器就被彻底污染了。

其实，采用合适的柱子和梯度，甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵等一般都能解决保留的问题，即使对于氨基酸这样的物质。赵老师谈到自己曾做过28种氨基酸的方法，梯度是比较复杂，但都能出来，对反相柱也没有特别的要求。

同时，提醒大家自己注意一下有机溶剂的纯度，用质谱可以很好地测试出来。赵老师做过一些对比的本底实验，有机溶剂的本底差别很大，有些标为色谱纯的，但本底很高，提醒大家注意。为什么有些色谱纯的其实本底很高？因为色谱纯溶剂的检验方法是用UV检测的，但有些厂家不是好好想办法去纯化溶剂，而是针对检测方法去加紫外掩蔽剂。这让笔者不禁想起奥运会上的兴奋剂检测，也常常遇到这类问题；当然，他们加的是质谱掩蔽剂。所以，我们也呼吁更多的分析测试工作者，练就真正的“火眼金睛”，不断探索先进的分析方法，让这些妄图“以假乱真”的产品无藏身之地，肩负起更多的社会责任。

（7）AB质谱的维护：三个月一定要换机械泵的油，最长最长不要超过半年。花费不大，200元就能买一桶，可如果不换带来的危害非常大。赵老师就曾见到一个分子涡轮泵坏的用户，机械泵已经空了，根本就没有前级抽力，压力全在分子涡轮泵上了。这让笔者又不禁想到，开车的人一般都清楚，一定要常检查机油，车还要定期保养，换机滤、空滤。这么昂贵的一台液质联用仪，只要大家平时好好待她，相信她不会让大家失望的。

赵老师还表示，欢迎大家来向他要一些资料，尤其是一些电喷雾基本原理方面的。真正理解了电喷雾的原理，很多问题也就迎刃而解。电喷雾最基本的四个条件是：要有一定的流速、要有电解质、要有高电压形成电场、要有辅助气体。希望大家有时间去好好看看电喷雾的原理。

由于赵老师不仅质谱经验丰富，液相方面也具有及其丰富的经验，所以，大家提问更加踊跃。

（8）ESI电离效率和有机相比例有严格的关系么？有用户问，是否有绝对的一个规律，有机相的比例增大将有利于电离。赵老师明确回答：没有。比如，用户提到曾经听过一个国外的报告，报告人比较了奎诺酮在30％和70％有机相的信号响应，想说明有机相提高将有利于ESI电离。赵老师看来是对此深有研究，他说，奎诺酮这一类药共有13个化合物，在液质联用时，有机相绝不能高过50%，因为如果超过50%，好几个化合物没有保留就出来了。而用户举例的那个报告人，也许是想用直接进样的方法说明，但其实液质联用时不是这么回事儿。由此，赵老师也希望大家要重视一点液相对于质谱的作用。如果液相方面改进一下，有些情况可以获得非常好的效果。因为很多实际问题是需要用液质联用来解决的，而只考虑直接进样的条件是不行的，因为直接进样和液质联用时，质谱的条件是不同的。

由这个问题引发，还有用户问一个关于瑞典某公司Hilic柱子的介绍：“通常Hilic的洗脱溶剂是40%～67%乙睛或者是用挥发性的缓冲盐，所以Hilic在用液质联用时，对亲水性化合物的质谱灵敏度要比反相柱提高10～1000倍。” 赵老师耐心地解释，其它公司的不了解，但Waters公司的Hilic柱子只能做一类非常特殊的化合物——有机季铵盐，只对这类物质有保留，因为它是一个纯硅胶柱，没有任何别的基团，在硅胶表面进行了强化处理，可以见水；但只能做有机季铵盐，其它物质没有保留。他估计其它公司的Hilic在上面又加了一些基团。至于提到质谱灵敏度提高10～1000倍，赵老师的看法是，这不是关于灵敏度比较的问题，而是有没有的问题。比如有机季铵盐类以前只能用离子色谱做，用反相柱和质谱联用根本就没有保留，而用了这款专用的柱子就有保留了，可以做质谱了。当然，这种柱子是针对特殊的化合物的，使用条件也不会是通用的，比如Waters公司的Hilic柱子也只能在酸性条件下做。（注：据笔者了解，Hilic是最近比较新的一种填料技术，用于亲水的正相色谱。虽然液质联用是一种越来越流行的技术，但某些化合物，比如一些极性的适合于做离子色谱的化合物，在反相柱上没有保留，所以还不能应用于液质联用。当前世界上至少有两种研究思路：一是开发离子色谱和电喷雾质谱的接口；二是发展新型的填料柱，比如这种Hilic柱。）

关心柱子的还问市场上现在已有的pH 1～12的柱子，赵老师认为在碱性条件（比如pH>9）的情况下运行柱子，柱子的寿命还是会比较短。

（9）关于前处理：比如对于血样，如果前处理不干净，磷脂的干扰会很大，会对灵敏度有很大影响。赵老师也做了很多不同前处理方式的比较实验，比如蛋白沉淀离心、液液萃取、SPE等，结果表明SPE的方法还是最好的，可以最大限度地减少离子抑制效应。而对于只愿用蛋白沉淀离心法的用户，还有一个小窍门，就是离心定容后，先放在零下2℃冰箱中冷冻一下（大概半小时），一些磷脂会分出来，把清液抽出来再进样，结果会好很多。分离的形态呈一层薄薄的油状，但常温再放置一段时间又复溶了。

面对如此热烈的问答，主持人只好暂且打断，来进行下一个报告，也希望大家可以在工作中继续探讨更多的典型问题。同时笔者再次由衷地感到，仪器公司里常有很多经验非常丰富的应用专家，他们对多种不同条件下的工作都有很多探索，他们常常具有积极探索的精神，接受各种挑战性项目的勇气，同时又默默无闻，乐于奉献。对他们来说，帮助用户取得事业上更大的成功常会使他们获得巨大的满足。而我们平时总是看到他们日日奔波在外，很多人一年200多天出差、在用户现场为用户排忧解难，比如赵老师就是在非常忙的工作中抽出时间来质谱沙龙，但已经给大家带来了如此多的收获。同时我们也了解到，各大公司对工程师的管理也很规范，获得用户的满意度是对他们个人工作的一个很重要的评价；可有时也会听到一些用户对工程师们的一些抱怨，而有些情况可能仅仅是沟通的问题。所以在此，我们呼吁大家都能更多地理解和尊重工程师们的工作，让出门在外的工程师们，可以更快乐地为用户们奉献。

HPLC/MS在胶类药物质量控制中的应用

来自中科院过程工程所国家生化工程重点实验室的张贵锋博士，为大家介绍了一种新型的中药质控方法，令人耳目一新。他先从“中药现代化”的发展讲起，介绍了一些基本概念，比如：中药包括植物药、动物药、矿物药等5000多种，十五期间我国取得了一系列的中药质量控制的重要进展，出台了一系列的中药质控标准，比如控制终端产品的比较成熟的中药指纹图谱。但中药指纹图谱大都用于植物药，用于动物药存在很多问题。中药指纹图谱方法包括：色谱指纹图谱、光谱指纹图谱、DNA指纹图谱。而动物药分子量很多呈连续分布，没有明显的紫外吸收，亲水性比较强。动物药的生产工艺不稳定，添加的辅料也不相同，所以导致各个厂家、利用相同的原料生产的同一种动物药光谱性质相差很大。动物药在生产过程中，很多DNA被破坏掉了。所以传统指纹图谱的色谱、光谱、DNA法应用于动物药都存在问题。所以，开发动物药真伪鉴别的可靠方法非常有意义。

张博士小组选择了动物药中的典型胶类物质——阿胶来研究，因为：（1）有市场，我国阿胶年销售额超过40亿；（2）药典中规定了阿胶用驴皮做，制造工艺规定得较笼统，再加上伪劣阿胶采用驴皮外的其它动物皮，因此市场上的阿胶产品是一系列复杂的混合物，分子量连续分布且性质相似；（3）阿胶产品的分析难度大，传统的阿胶真伪鉴别技术都不成功，稳定性差、重复性低、缺乏理论依据。所以，导致市场上存在许多伪劣阿胶，真伪难辨。

张博士小组首先设计研究思路：前期分析了阿胶中的固有稳定成分，比如：蛋白80%、糖类7%、脂肪和有机酸等；而主成分蛋白质中85％的成分属明胶类，所以，分析清楚了明胶是来源于哪种动物，就可以解决问题。已有文献介绍的几种方法也都不稳定、不可靠。

张博士他们最后选用的鉴定技术路线如图所示。我们很吃惊地发现，这个方法是蛋白质组学中一个典型的寻找生物标志物（Biomarker）的方法。它基本采用“shotgun”鸟枪法的思路，因为阿胶是一种混合蛋白质的复杂体系，将这个体系直接酶解成混合多肽，用LC-MS/MS方法，再借助谱库检索，可以找到多达40多种特征性的Biomarker（多肽），从而可以鉴定来源于不同动物的明胶的差异。

明胶动物来源分析的思路

明胶识别实施方法

阿胶酶解产物中检测出的特征多肽

当然在实际实验中，为了使方法更可靠、前处理更简单，使其真正成为一个可以推广的可靠的真伪识别方法，张博士的小组进行了多年的研究。比如：世界上没有驴胶原蛋白的序列，SwissProt中没有，连基因组序列库中也没有，张博士小组花了一年半的时间来测定驴胶原蛋白的序列，并通过一系列实验证实了找到的胶原蛋白的Biomarker是特异性的。这些工作在世界上都是首创的。同时，在整个项目中还探讨了羟基化修饰的影响、分子量范围的影响等。

目前，张博士小组还在继续拓展这种方法的应用，比如如何检测从疯牛病和口蹄疫发生国进口的生物制品；穆斯林国家如何检测含动物胶的药物、食品（如明胶空壳胶囊）等。他们已经发表了30余篇论文，并申请了两项国家ZL。

这项工作在2006年进行包含四位院士在内的专家组项目论证，其后，东阿阿胶和张博士所在实验室即鉴定了合同，据了解，东阿阿胶在阿胶市场上占有50%以上的市场份额。2008年4月份，东阿阿胶组织医药管理局、中检所、药典委各方对该方法进行了质量标准的论证。最后，张博士非常诚恳地请沙龙成员提出批评指正意见。

张博士刚一介绍完，大家不约而同都鼓起了掌。在座有几位蛋白质组学的专家，都提出了很多细节的问题，张博士回答的细节越多，在座的听者就越能感受到他们在这项工作中的投入之艰辛，和考虑问题的严谨。比如：他们考虑了使前处理尽可能简单并证实了其可行性；他们遇到了蛋白质组学中常遇到的修饰的问题并想办法去解决；他们考虑了用尽可能大的肽作为Biomarker等等。这里，在座来自中科院微生物所的罗元明博士也给我们“普及”了一点蛋白质组学的知识：如果鉴定了一个十几个氨基酸的肽断，并获得了MS/MS二级质谱，这个肽特异性就是非常高的，即同源性很低。而张博士他们找到了几十个特异性的Biomarker。这种方法直接用质谱特异性的MS/MS，所以不用考虑色谱保留时间的重复性问题。从罗博士的话语间，我们能感觉到他曾经为张博士提供了很多蛋白质组学方面的帮助；而张博士本人的实验室是做蛋白质分离纯化和生化工程的，我们从中可以感受到跨学科产生的合作力量。

笔者对蛋白质组学也略知皮毛，这里忍不住感悟如下：

（1）蛋白质组学是一个非常前沿的、研究难度很高的学科，目前的热点是寻找Biomarker，它面对的体系是非常复杂的体系，无数的科学家们已经发展了很多方法，但在实际应用中，比如预期的疾病Biomarker的寻找和临床诊断、治疗中，应用还很困难。因为要寻找的那个Biomarker往往是极痕量的，又被淹没在大量的没有意义的丰量蛋白之下，这对方法的灵敏度，如何克服浓度高达10⁸的动态范围等难题，都是严峻的挑战。

（2）张博士的小组开创了一种新型分析方法：借用前沿的蛋白质组学方法，来研究一个质控问题，上面提到的问题反而不存在了。因为样品是常量的，可以检测到很多个Biomarker，实验也可以稳定重复。而在蛋白质组学中，在差异的体系中鉴定出两个特异性肽段，就已经是非常了不起的。这应该归功于无数蛋白质组学、基因组学的先辈们创建的庞大的数据库，和开创的各种方法学？还是归功于张博士小组智慧灵光突现的“拿来主义”？还是归功于跨学科之间的融合和沟通？

（3）把前沿研究已经成熟的部分拿来做标准，相信张博士小组不是第一个。分析测试百科网（antpedia.com）创建之初，提出的口号是：“致力于推动国内外信息的融合，致力于推动不同领域间知识的融合，致力于推动创新性与规范性实践的融合。” 张博士小组的这项研究，几乎表达了、或者说是提前演绎了antpedia致力于去做的全部。

报告下载：LCMS在胶类药物质量控制中的应用

固相萃取技术在生物样品分析中的应用

来自艾杰尔科技的杨定忠先生，为大家介绍了SPE技术在生物样品分析中的应用。他大致介绍了一下生物样本分析中的挑战，和SPE的一些基本特点，并和蛋白沉淀法、液-液萃取法进行了比较，并专门介绍了艾杰尔科技的特色产品——Cleanert PEP，PEP是一种以聚苯乙烯/二乙烯苯为基质的填料，Cleanert PEP的特点为：

（1）通用型SPE，表面同时具有亲水性和憎水性基团，对各类极性、非极性化合物都具有均衡的吸附作用；pH使用范围为1～14。

（2）主要用于强极性化合物的提取上，如酚类，四环素类等。这里，杨先生专门比较了PEP和C18固相萃取柱的差别：在传统的SPE操作时，大家会怕SPE抽干了，因为抽干会严重影响回收率，所以每个步骤都要守在SPE旁边，同时处理多个样品时会手忙脚乱；但用PEP产品，由于其具有良好的水可浸润性，即使抽干了也不影响回收率，所以大大方便了实验，也可以同时处理更多的样品。

（3）性质跟Waters的Oasis HLB非常相似，使用时只需稍微改动1～2个参数。

当然大家会比较关心他的价格。杨先生没有正面回答，请大家有兴趣地看一下他给的资料。笔者也看到：这款60 mg/3mL，50支/包的Cleanert PEP，报价是￥1035，相当于每支20元；而Waters的Oasis HLB，每支大约60元。

杨工随后简单介绍了更适于复杂样品前处理、处理更干净的PCX/PAX小柱。

最后介绍了如何进行SPE方法的开发和优化，和301医院合作开发的方法《Agela固相萃取柱和液相色谱柱在血浆中油酸及其代谢物LC-MS分析中的应用》。

据了解，艾杰尔科技是一家专业从事现代分离技术产品开发和生产的高科技公司，致力于把SPE做到全球前三名。他们的总部在美国，在中国有生产基地天津博纳固体材料科技有限公司和经验丰富的销售队伍，不久前还中标了科技部的“高性能色谱分离材料和色谱柱的研制”课题。他们的产品远销全球二十余个国家，并可根据用户需求定制产品，并协助用户开发方法。

从多次的活动中，可以感受到大家非常希望讨论前处理问题，所以这次沙龙邀请了前处理的专业厂家，介绍一些应用和特色的产品。

报告下载：固相萃取技术在生物样品分析中的应用