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【求助】血清/血浆标本中检测miRNA的内参选择
在做血清/血浆中miRNA的RT-qPCR时发现目标miRNA可以较好的检测到，但是根据查询后确定的内参RNU6B却没能得到较好的扩增结果，CT值都在35以上。请教有经验的研究者们如何选择血清/血浆miRNA的内参？参照芯片数据是否合适？如合适应如何选取？谢谢各位！【求助】血清/血浆标本中检测miRNA的内参选择
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最新回复
whitesheep (2015-9-04 17:05:30)
JK.jon (2015-9-04 17:05:52)
感谢楼上的回答，miR-16在某些报道中提示与肿瘤和溶血有关，在我们的实验中虽然没有设计这两方面，但是样品间均一性并不好；cel-miR-39是现在较多实验室的选择，但是由于国内大多使用的标本处理及提取条件方面的问题，可能会受到掺入量和保存状态的质疑；您提到的两外三种方法我没有接触过，可否给予更详尽的介绍？
gmjghh (2015-9-04 17:10:17)
天根的盒子用5S做内参，个人认为5S的量应该大得多，可以考虑。楼主若有结果和大家分享一下啊
JK.jon (2015-9-04 17:11:08)
感谢楼上的帮助，请问有5S做血清/血浆miRNA实验内参的经验或者预实验结果么？
小明 (2015-9-04 17:12:23)
JK.jon (2015-9-04 17:16:55)
QUOTE:
你好，请问你们的样品是什么？小明 (2015-9-04 17:17:25)
QUOTE:
血浆junhun (2015-9-04 17:18:09)
QUOTE:
你好，你说的u6和RNU6B是一种control吗？dog002 (2015-9-04 17:18:33)
to 跟帖的战友：
根据我个人的经验谈一下血液内参的问题：
1 首先应该确认一下是不是内参和目的的microrna都做了，因为如果只做了U6，发现Ct值很大的话，就下结论说这个内参不好是不太科学的，也许是你提取的RNA量或者反转录时加入的rna量就少。目前U6在血液中做内参的还是不少的。一般Ct能够在20-25之间。提示：由于U6的序列长度大于200，所以在提取时看一下试剂盒说明，例如，如果说试剂盒说明书中提到采用这种方法提取只能提取到nt小于200的片段，那实验就白做了。
2 mir-21，mir-16，mir-126也有人用来做血液mirna选为内参的
3 本来内参就是根据自己的实验才能确定的，没有千篇一律的内参。只能说U6大家使用做内参的概率比较大，但并不一定真的适合你的实验。
junhun (2015-9-04 17:18:58)
QUOTE:
RNU6B: U6 small nuclear 2 RNA，谢谢你啊baidukk (2015-9-04 17:19:45)
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你好。我做血浆的miRNA定量PCR，SYBR green法。设置了两个阴性对照组，一个是无模板组，一个是无MMLV逆转录酶组。两个组出现了和阳性组一模一样的PCR产物：跑胶位置一样；融解曲线Tm值一样。
我尝试优化引物浓度，温度，还是这样的。
有一点。我做的是血浆的，模板用量少，2ul。您给分析一下？
我都博二了，三年制博士。急死我了
JK.jon (2015-9-04 17:20:20)
我尝试优化引物浓度，温度，还是这样的。
有一点。我做的是血浆的，模板用量少，2ul。您给分析一下？
我都博二了，三年制博士。急死我了
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我用的是taqman探针法，目前体系还算稳定，至于你的实验设计我没有看明白，无模板组和无逆转录酶组是在PCR扩增时应该是没有目标cDNA的，不应该有何阳性组一样的PCR产物，是这个意思么？有几点不明确，无模板组指的是逆转录模板还是扩增模板？逆转录酶在染料法用的应该是通用的逆转录酶，是否在你的实验中该过程没有加过任何RNA依赖的DNA合成酶？PCR过程中扩增引物是特异的么？溶解曲线波峰怎么样？说实话，虽然都是PCR，探针法和染料法还是有很多不同之处的，希望我没有理解错
chengjie79 (2015-9-04 17:20:55)
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战友你好，我现在正准备做细胞和组织的miRNA ,我刚接触这方面，有好多问题整不明白，可以向你咨询学习吗？
jude (2015-9-04 17:21:43)
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你好，我现在也做血清的miRNA,不知道选择什么内参比较好？请问您现在找到合适的内参了嘛？ｍｉｒ－１６和ｃｅｌ－ｍｉｒ－３９这种怎么样呢？
yes4 (2015-9-04 17:22:00)
请教血清中是提取哪些细胞的哪些mRNA ?
ztonyc (2015-9-04 17:23:30)
我的样本是人的血清，也是用U6作为内参，平均Ct在25-26左右，但是个别样本差距很大，有21Ct，也有29Ct的，希望你们给我推荐一个相对更稳定的内参或者内参组。
shenkunjie (2015-9-04 17:23:57)
你好，我想问一下你血浆miRNA最后用的什么做内参？谢谢
abc816 (2015-9-04 17:24:46)
想请问一下，我是用life公司的U6做内参，样本是人外周血PBMC。但是内参也不稳定，CP值在20-28之间。目标基因CP值在26-35之间。请问你的内参稳定吗？内参差别多少可以接受呢？目标基因表达量低，不知道后面结果怎么样。请指教。谢谢啦！！
mogu (2015-9-04 17:25:32)
我是用线虫Cel-mir-39做内参,内参CT值基本在17-21之间,,,但是对PCR数据处理有点困惑,我是96孔板,那位大神指导一下我?
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