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【求助】PCR反应总是污染什么原因？

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2016-2-29 17:09    作者: xevin    来源: 分析测试百科网

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【求助】PCR反应总是污染什么原因？
做普通的pCR反应总是污染，做的时候很小心了。出现污染好几次了，每次污染解决后隔的不久又会污染，污染的东西从水，酶，引物都有过。请问这可能是什么原因造成的？我总是更换试剂也不是办法。希望各位大大支支招吧！不胜感激。
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  • SO2 (2016-2-29 17:11:55)


    也许是加样的时候不小心吧.
    配Mixture，分装到各个管子，模板最后加。细心一点应该不会总是污染的哈。

  • xevin (2016-2-29 17:12:15)

    不是这样的，已经很小心了。每次都是分装的啊！会有别的原因吗？

  • mamamiya (2016-2-29 17:12:30)


    加样时每次都更换一个枪头了吗
    我觉得是枪头没换的原因，
    每次换枪头
    但是有些时候感觉不需要，
    也麻烦

  • join (2016-2-29 17:12:47)


    加样的时候当然要换枪头，根结也是如此的，枪头不换的话，那么各种试剂混合在一起，尤其是模版之间的污染很快就会污染，作PCR这是最基本的，如果怕麻烦可以购买专门插枪头的试剂盒，或是直接的从你刚开始购买试剂的公司要一个免费的，有专门插小枪头的盒子，你可以插完后直接丢弃就可以了。但是记住作PCR不要怕麻烦一定要注意不要污染，因为PCR是很敏感的。

  • ending (2016-2-29 17:13:08)

    因为PCR产物的量很大，可能很小的量就可以污染你下次的PCR，而且这种污染一般都是接触污染的可能性比较大，所以你的解决办法只能是把你原来的试剂全部不要，引物最好是重新配制储存液，每次稀释引物时最好是新打开的注射用水。还有要考虑你的枪是否有污染，可以清洗一下

  • xevin (2016-2-29 17:13:24)


    谢谢各位，具体情况是我每次发现污染了，就全部试剂都换掉，可是再做几次之后又会污染.有时是引物，有时是酶，后来我就不去管是什么被污染了。而枪头当然是用了就换，加了样就丢掉。不重复利用的。
    另外请问一下，假如是枪污染了，怎么清洗？

  • any333 (2016-2-29 17:13:50)


    枪可以拆卸下来，把你的前部用洗涤灵洗后用大量水冲洗，然后用DEPC水配制的酒精擦拭干净。

  • minran_1980 (2016-2-29 17:14:10)

    第一：换带虑芯的吸头，会稍微好一点；
    第二：提取，配液，加样，电泳，四个过程，分开四套加样器，尤其电泳，需要专门的加样器、吸头盒和实验台，实验室条件做不到的情况下，至少也得把电泳跟前面三个步骤分开来。

  • xevin (2016-2-29 17:15:23)

    谢谢各位，先试试看洗洗枪吧！

  • 3648755 (2016-2-29 17:15:47)

    实验室有多少人作实验，有无相同情况？
    换把加样器试试？
    用了开放式电泳，是很容易导致实验室空气污染的，如是，那就麻烦大了。

  • redbutterfly (2016-2-29 17:16:03)


    你的PCR管子没有问题吧？
    介意你用好一点的，比如BBI级别的RNase FREE的管子试试，
    有时候我觉得是加样管自身的问题，特别是劣质的PCR管，没有经过硅化处理，灭菌后还是很容易被污染的，化学试剂一般不容易被污染的

  • xevin (2016-2-29 17:16:20)

    枪是不会拆了，我们用的吉尔森的，似乎很难弄的。现在我换了一间屋子做PCR，枪也换了一批。各种试剂都分装了。貌似这几次都没有污染。估计可能是气溶胶污染或是枪污染。现在也不确定！再做一段时间看看。PCR管应该没问题。实验室其他人做也都没污染。不过他们都是做长片段，我是做短片段的。不知道这会不会是我污染他们没污染的原因？

  • tuuu2 (2016-2-29 17:16:38)


    PCR试剂配制和加样最好分开2个房间，估计你就不回污染了 ，或者试剂配制在超净工作台进行，加样在外面。也许会哦好点

  • 49888 (2016-2-29 17:16:57)


    有目的带吗?如果有的话,污染也没问题,直接把目的带回收就可以了。

  • 少林弟子 (2016-2-29 17:17:21)

    很多PCR实验室设置的有问题，如果你做的是临床样品，而同事们的长片段是用质粒做模板，那么你的实验出现污染就很正常了。

  • feima+ (2016-2-29 17:17:42)


    实验中低温是个非常重要的因素

  • kewanqi2011 (2016-2-29 17:18:01)

    可以从以下几个方面预防污染：
    1.标本( 细胞、组织等）本身要在超净台中提取RNA，超净台的紫外线消毒可延长至40分钟。
    2.实验所用的枪头、EP管等要DEPC泡过后消毒（可适当延长时间），消毒后一定要烤干。
    3.所有的PT-PCR试剂要在超净台中打开使用，用过立即盖盖子。尽量低温中操作。
    4.所用的枪可以放在超净台中消毒或者使用前用酒精消毒棉球擦拭。

  • greenbee (2016-2-29 17:18:58)


    楼主的PCR产物片断多大？一般产物片断越小，越容易引起污染。用带滤芯的枪头操作吧。

  • 45778 (2016-2-29 17:19:21)

    如果常规防范，不能排除污染，考虑酶的原因。酶有的时候本身就含有一些微生物。

  • ququer787 (2016-2-29 17:19:41)

    直接买混合好的东西的了里面有dNTP,Taq酶，染料。自己就加一些水，引物和模板。其余都配好的啊。挺好用。污染肯定少。我就这样干的
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