【求助】SDS-PAGE 跑得惨不忍睹,请大家帮忙分析以下原因

最新回复

• duoduo (2014-7-07 18:04:09)

  蛋白制备可能有问题，因为marker还是可以的。

• pengke1983 (2014-7-07 18:04:59)

  降低上样量，上样前充分离心。

• lxh031 (2014-7-07 18:06:32)

  上样量太大了，适当降低上样量。还有感觉上胶好像有问题，建议你检查一下配胶时的操作。

• ending (2014-7-07 18:06:48)

  
  你的胶从左数第3，5泳道应该没有上样吧。
  这种情况最好在这些泳道和没加样的泳道里加满SDSbuffer，防止其他泳道的蛋白往空泳道这边挤；
  另外，你加样时可能有些不小心，样品溢到外面来了，污染了周围泳道，因为Marker右边的泳道似乎也有带了；
  还有，电泳缓冲液如果用2次以上就会出现许多横的纵的条纹背景，不容易脱干净，感觉你这块胶就象这种情况。

• ending (2014-7-07 18:07:04)

  
  我的SDS-PAGE前处理步骤：（提供给新手，也希望得到高手的指点）
  1 样品从冰箱里拿出，融解，振荡使一些沉淀析出的蛋白重新溶解；
  2 充分离心，去除可能存在的小的不溶颗粒；
  3 安装样品的浓度加20ug蛋白（要先定量的），用1×SDSbuffer补总体积到25ul；
  4 沸水浴7min；
  5 离心1min，使水浴时蒸发凝结在离心管壁和盖上的溶液重新回到管底；
  （此步骤很重要，不然加样时溶液体积都不够，而已量也不同）
  6 加样

• lxh031 (2014-7-07 18:07:18)

  请问第二步充分离心要多大转数及多长时间呢？我一般12000rpm，离心15-20分钟，是不是有些过分呢？

• ha111 (2014-7-07 18:07:35)

  
  12000rpm 1min

• moonlight45 (2014-7-07 18:07:55)

  
  最主要的原因就是蛋白量太大了.和本人前两天所做的几乎一样,结果把蛋白上样量降低了十倍后,结果就明显改善了.

• duoduo (2014-7-07 18:08:13)

  
  我认为，你上样的时候，不要有空的孔，煮过以后要13000离心至少5分钟。
  另外你的样品中的盐份也不均一，从而出现积压的现象，
  如果你的胶是银染的话，有点过了

• koook5695 (2014-7-07 18:08:29)

  
  看你的前沿和Maker,你的胶铺的肯定有问题,不是均态!!!