【求助】脂质体转染

最新回复

• shenkunjie (2014-11-03 17:39:05)

  
  我用的EGFP的质粒转染后12小时观察已经看见荧光,你指的空质粒是什么意思?具体是哪种GFP质粒啊?

• bgf5 (2014-11-03 17:39:25)

  
  共转染应该和DNA的纯度和浓度有很大关系吧？一般我们在做的时候，老板都要求260/280在1.7~1.9之间，偏近1.8，否则就要重做。 DNA在加入脂质体的时候应避免出现气泡。 在将混合液体加入培养细胞的时候应该是边加边摇，并尽快加入。 自己的经验，不知是否正确，仅供参考。
  

• join (2014-11-03 17:39:47)

  什么细胞啊，有的细胞长的较慢，要过更长时间才能观察到绿色荧光
  

• flower@@ (2014-11-03 17:40:12)

  一般12小时后就能看到绿色荧光。 至于得到稳定的细胞，至少需要1个月哦，这是很顺利的情况

• birdfish (2014-11-03 17:40:38)

  1，是否细胞再长多一点再转比较好； 2，你用的是不是罗氏的fugene系列？fugene对容器材质要求很高，而且要求不得分 装，我有一同学把fugene分装后再转细胞就不行了。 3，抽的质粒跑过电泳吗？说实话，我对国产大抽试剂盒不甚放心。
  

• ladyhuahua (2014-11-03 17:41:10)

  请教一下，你的转染效率能有多大啊 估计一下吧，谢谢

• dodoit (2014-11-03 17:41:29)

  你转染的，是什么细胞系呢？

• kuohao17 (2014-11-03 17:42:08)

  老大，有没有筛过7721细胞啊？G418加多少才行？

• she (2014-11-03 17:42:25)

  
  那你的细胞可真牛！我筛的7721加到800，转染组的细胞就只有几小群蹲在板子角落里，不死也不长，真急死我了，恨不得加10倍血清给它喂饱！怎办呢？

• xiaoxiaoniao (2014-11-03 17:42:55)

  
  你是否用的刚构建的新质粒，如果是验证以下是否连接对 如果质粒没有问题，你转的是何种细胞，有些比较难转

• wood533 (2014-11-03 17:43:39)

  用脂质体做共转染，和磷酸盐共转染有什么区别？经典上使用磷酸该做的.请高手 告知。

• zzzz (2014-11-03 17:44:20)

  
  你们谁做过GFP融合蛋白的稳定表达吗？谢谢！

• vvmmoy (2014-11-03 17:45:06)

  QUOTE:

  原帖由 zzzz 于 2014-11-3 17:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  你们谁做过GFP融合蛋白的稳定表达吗？谢谢！

  做过的，用3T3、293细胞筛，挺好做的，在荧光显微镜、confocal下都能看到绿色，用抗GFP抗体做western也做的出来。只不过融合了目的蛋白后，荧光比单纯GFP要弱不少。

• wood533 (2014-11-03 17:45:23)

  
  如果DNA用量不是太太多的话，做一次2L左右的大提应该就可以满足了。传统的酚/仿抽提就足以完成这样纯度的要求了，当然要记得消化RNA,呵呵

• hold住 (2014-11-03 17:46:01)

  在转染的过程中怎样作到无菌啊，是在转染后加抗生素吗？

• ending (2014-11-03 17:46:19)

  
  脂质体转染前一定要好好看看PROTOCOL。 我的体会是： 1、要保证质粒没问题。我前两次做的时候，目的质粒就没有表达，可对照的GFP没问题。反复查找原因，目的质粒重新测序才发现有突变。到现在我还没弄明白。只有重做克隆。 2、在做转染时，一定要加对照。 3、转染前要测质粒的纯度和浓度，这样才能做到心中有数。 4、无菌问题可以不考虑。质粒抽提时过柱，相当于已经抽滤了一次，在转染的操作过程中只要注意无菌原则就行了。我转染后的细胞还没发现有污染的情况。在转染后，按实验要求可以使用含抗生素的培养液。

• any333 (2014-11-03 17:47:06)

  
  为了提高转染效率，应从以下几个方面下手： 1. 质粒的质量：用进口的去内毒素的质粒试剂盒，因为大肠杆菌产生的内毒素会影响转染效率 2. 脂质体： lipofectin为Invitrogen的产品，主要用于Stable transfection。Lipofectamine 2000用于瞬时转染效率最高。 3. 质粒和脂质体的量以及二者的比例很重要，有参考文献可以的话，参照文献（注：要那些高水平的杂志）如无，你可以先固定质粒的量，再摸索脂质体的量。 4. 转染前细胞融合率。 5. 转染用的液体，最佳推荐Opti-MEM® Reduced Serum Medium。 一旦条件固定下来，不能更改，因这将影响实验的重复性。

• free (2014-11-03 17:47:33)

  为了提高转染效率，应从以下几个方面下手： 1. 质粒的质量：用进口的去内毒素的质粒试剂盒，因为大肠杆菌产生的内毒素会影响转染效率 2. 脂质体： lipofectin为Invitrogen的产品，主要用于Stable transfection。Lipofectamine 2000用于瞬时转染效率最高。 3. 质粒和脂质体的量以及二者的比例很重要，有参考文献可以的话，参照文献（注：要那些高水平的杂志）如无，你可以先固定质粒的量，再摸索脂质体的量。 4. 转染前细胞融合率。 5. 转染用的液体，最佳推荐Opti-MEM® Reduced Serum Medium。 一旦条件固定下来，不能更改，因这将影响实验的重复性。
  

• free (2014-11-03 17:48:39)

  
  为了提高转染效率，应从以下几个方面下手： 1. 质粒的质量：用进口的去内毒素的质粒试剂盒，因为大肠杆菌产生的内毒素会影响转染效率 2. 脂质体： lipofectin为Invitrogen的产品，主要用于Stable transfection。Lipofectamine 2000用于瞬时转染效率最高。 3. 质粒和脂质体的量以及二者的比例很重要，有参考文献可以的话，参照文献（注：要那些高水平的杂志）如无，你可以先固定质粒的量，再摸索脂质体的量。DNA在加入脂质体的时候应避免出现气泡。将混合液体逐滴加入细胞内，轻晃混匀，培养6小时，在将混合液体加入培养细胞的时候应该是边加边摇，并尽快加入。 4. 转染前细胞融合率，每种细胞都不同。 5. 转染用的液体，最佳推荐Opti-MEM® Reduced Serum Medium。 一旦条件固定下来，不能更改，因这将影响实验的重复性。

• qiangren789 (2014-11-03 17:48:59)

  G418筛7721浓度380ug/ml够了