【求助】关于大片段连接效率低的解决办法

字体: 小中大 | 打印发表于: 2015-4-02 15:16 作者: 小鱼鱼来源: 分析测试百科网

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【求助】关于大片段连接效率低的解决办法

各位大侠：
小弟初来乍到，不懂规矩，望见谅！
最近做连接转化蓝白斑筛选，阳性结果很少，可能是连接效率低的原因。目的片段约1400bp，请问如何提高连接的效率？

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最新回复

pou (2015-4-02 15:17:17)

你问一下你们实验室有没有人跟你用同一个连接酶，他们用的效果怎么样，连接酶会对连接效率造成很大影响；
其次在凝胶回收那一步要做好，如果回收的不好的话也会使连接效率变低。我用的是biomiga公司的回收试剂盒，效果还行。1400bp的片段应该算不上大片段，我做的是3000bp的片段
小鱼鱼 (2015-4-02 15:17:34)

他们有用同一种酶连500bp左右的片段，效果还可以。不知你们用的是什么酶啊？
pou (2015-4-02 15:17:51)

高保真的PFU酶，北京全式金公司的，载体用的是配套的T-easy
小鱼鱼 (2015-4-02 15:18:19)

我用的是tiagen的T4DNA连接酶，配套的pGM-T，这个不行吗？
pou (2015-4-02 15:18:37)

我也不清楚，PGM-T的载体我用过，但是用的不是你前面的酶，应该是和这个载体配套一个公司的酶，具体哪一种我也不太清楚了，不好意思哦
小鱼鱼 (2015-4-02 15:18:58)

QUOTE:
原帖由 pou 于 2015-4-2 15:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
我也不清楚，PGM-T的载体我用过，但是用的不是你前面的酶，应该是和这个载体配套一个公司的酶，具体哪一种我也不太清楚了，不好意思哦
嗯，没事。
yes4 (2015-4-02 15:19:14)

我也遇到了相似的情况，我的目的片段是4000多大小的，载体是PMT/V5,3000多，连接了好几次效率都很低，用的是T4连接酶，这次出来张的斑很少也，以前的几次都不长斑的……
yonger (2015-4-02 15:19:30)

用好一点的连接酶吧
chengjie79 (2015-4-02 15:20:01)

我也是就是连接不上排除了很多方面我没有凝胶回收而是酚氯仿纯化一直连不上质粒也验证切开了出来的菌做菌落PCR电泳验证条带位置就是空质粒
快郁闷死了
veiwu (2015-4-02 15:20:25)

我刚做了一次，用的是T4连接酶，载体用pUC19，没问题啊，效率还可以