【求助】我的引物退火温度怎么算？

最新回复

• hulu呼噜 (2015-7-01 21:54:27)

  我的引物是用的文献上面的，根据文献描述退火温度是55度，可是我pcr出来非特异性条带比我要的条带还亮而且出现很多非特异性的带，我该怎么调整呢？

• taoshengyijiu (2015-7-01 21:54:44)

  
  还是自己摸一下吧 有条带很好了 我一点都没有

• memory (2015-7-01 21:55:04)

  
  计算退火温度的方法：
  1. 退火温度＝4×（G＋C）＋2×（A＋T）－（5～8） 只是粗算，有时不灵，但比较简便。
  2.用primer5（or oligo6）计算，引物配对好后，primer5可以显示Tm，我认为这个值就是退火温度，我的经验再加2 or 3度最好。
  3.合成引物的单子上也有个Tm，减去5～8也可，但有些公司提供的Tm就是方法1计算的。
  我认为方法二最准确，不知道还有其他方法吗？

• XYZQ (2015-7-01 21:55:24)

  
  i am more worse than you, no any belt appear for 5 days. thus make me exhausted .

• XYZQ (2015-7-01 21:55:46)

  
  every one, good night i have have a sense chain and anti-sense chain need a expert to give me a hand.

• tie8 (2015-7-01 21:56:05)

  
  1、你没发现你这对引物之间可以配对么GGGTAT和CCCATA
  所以建议提高退火温度看看效果如何
  2、应尽量避免在引物3’端的第一位碱基是A。引物3’端最佳碱基的选择是G和C
  3、降低Mg离子和引物的用量

• XYZQ (2015-7-01 21:56:33)

  
  我是开始防暑假就开始做rt-pcr，到先在没啥满意结果（晕啊！） 曾经在8月7号出了几条480bp得条带，确实让我高兴一下，但是第二天以同样得体系和同样得退火温度.模板一样，除了引物二聚体外，啥也没有，实在没办法，昨天做内参，出来了，说明模板还没坏吧？体系内得 东西我们实验室其他人也做啊，说明也没坏吧？昨天上午请一位有做得多得姐做了，也是没结果啊！，下午又把引物重新配过了，我根本没加内参引物，到是批出几条在内参250bp得条带来，真弄不懂啊！
  我在别人得实验做，八月低就要结速啊！没办法，请各位大侠分析一下吧，小妹先谢谢师哥师姐了！！！
  今天又不知出啥带了？
  几次出带下来，感觉pcr得重复性太差了啊！

• XYZQ (2015-7-01 21:56:56)

  
  如果按楼上说得方法，我的primer 给我的引物退火温度是57.9和59.5度，在加2到3度，都要成61度了，又这么高的退火温度吗？？
  刚出道不久，请各位指点啊！

• wzqzy (2015-7-01 21:57:21)

  
  引物为20mer以上时：
  Tm = 81.5 + 0.41×(GC%) - 600/L
  其中L为引物的长度。这是计算引物的Tm。一般情况退火温度比引物的Tm低五度左右，不过要根据自己的情况摸索条件。祝你成功！

• cj_mondy (2015-7-01 21:57:48)

  
  引物为20mer以上时：
  Tm = 81.5 + 0.41×(GC%) - 600/L？？？
  看不懂，楼上能否再解释一下？

• hulu呼噜 (2015-7-01 21:58:26)

  
  还有一个关于引物与原序列符合的问题
  我的引物与ncbi上的原序列比对有2～3个碱基不符合，这样会不会影响RTPCR呢？盼望高手指教。

• jingling845 (2015-7-01 21:58:42)

  
  按照文献上面很多条件做都做不出来，我们实验室都是自己先摸温度梯度的，然后确定退火温度。还有因为基因组数据库有好几个，所以，有个别碱基对不上应该也是可以的，但是不能太多。

• flower@@ (2015-7-01 21:59:01)

  退火温度与延伸温度接近还更好呢
  你退火后，还要升温再连接，这升温也对退火的效果有影响吧？
  而退火后直接延伸不是更好么
  可以采取两段的PCR退火与延伸一块进行

• hulu呼噜 (2015-7-01 21:59:28)

  
  相关疾病：
  先天性卵巢发育不全综合征
  感谢各位老师的建议和指导。
  谢天谢地，我的RTPCR终于出来了，我把其中一条有错配碱基的引物按照原序列改回来又合成了一条，这次扩出来了。我是按照文献上面的退火温度是55设置的，但是条带不亮，而根据引物合成单上面Tm值是一个50，一个52，我想条带不亮是不是我的退火温度太高了呢？请各位老师再帮我分析一下。
  我的体系如下：
  10倍buffer 2.5ul
  10mmoldNTPs 1ul
  20pmol/ul引物 各0.5ul
  Taq酶 1ul
  模板cDNA 5ul
  双蒸水 9.5ul
  93度5分 （93度40s ，55度45s ，72度1m）X30，72度10分
  我应该怎么调整我的实验条件呢？

• flower@@ (2015-7-01 21:59:52)

  
  相关疾病：
  先天性卵巢发育不全综合征
  1、变性为什么93度，不设高点，94度45S
  2、Mg离子呢？多加点。反应体系中Mg2+浓度低时，酶的活力显著降低；一般Mg2+的加入量应比dNTP的总浓度高0.2~2.5mmol/L。
  3、引物的浓度一般要求在0.1~0.5µM之间，这一引物浓度足以使1kb的DNA片段在PCR反应体系中循环扩增30次。引物浓度过低，则产物量低；
  4、温度高没坏处，高于55℃的复性温度，可提高Taq pol的忠实性。多加几个循环。

• ns5fan (2015-7-01 22:00:13)

  
  退火温度还是自己摸一下比较好，计算永远是教条的。换台PCR仪可能都会不一样呢。