【求助】引物设计加酶切位点和保护碱基的问题

最新回复

• memory (2015-8-03 10:18:30)

  如果是在PCR产物两端加上酶切位点，则可以在正向与反向引物的5撇端加上，加啥碱基，就要看你要加的酶所识别的碱基序列，然后在再酶切位点前加上2-3个保护碱基，保护碱基也是根据不同的酶加不同的保护碱基，这些你都可以在网上搜索到的。
  不管加几个酶切位点都必须在引物的5撇端加，因为引物扩增的方向是从3撇端开始的。正确的引物顺序是 5-XX（保护碱基）+XXX（酶切位点）+引物序列-3。
  祝你成功！

• hyuu (2015-8-03 10:20:04)

  
  十分感谢楼上的回复，不过本人比较笨，我想问一下，加酶切位点能加几个啊，还有比如说我的引物是，上游引物5‘ AGCTGCAGGTCCTGAGC 3',下游引物是5’ TTCGCAGTCATGGCCTTAG 3',我想要加EcoR1的酶切位点，我的最终引物应该是什么样子的，还有引物会不会过长，加入酶切位点的引物P出来的结果是不是不好啊，容易出现非特异性的扩增产物吗。
  还有这个酶切位点加在了我的最终目的基因的哪个部分，我的目的基因两端都可以加酶切位点吗？
  希望大家多多帮忙，本人实在是太菜了，十分感谢大家，小人不胜感激

• 33号 (2015-8-03 10:20:46)

  酶切位点加在上下游引物的5端，而且你的上下游引物不可能加相同的引物，上游是EcoR1的酶切位点和保护碱基，下游就要换另一个酶切位点和保护碱基，而且最好不超过33个碱基就行，太长很容易错配，而且你要保证你的目的基因序列不能含有这两个酶切位点序列的相同序列，否则如果有重复的话，只要和酶切位点的序列相同，就会切开，这样的目的基因序列就不是完整的了。
  还有做实验之前请把相关基本原理、实验技术和文献看了
  不懂，怎么做实验。
  goodluck，希望我的建议对你有用。

• 33号 (2015-8-03 10:21:25)

  
  更正：“而且你的上下游引物不可能加相同的酶切位点”

• hyuu (2015-8-03 10:23:31)

  十分感谢楼上的,我想问一下，原先的引物再加上酶切位点和保护碱基，P出来的效率会降低吗？，因为我本来的引物效率就很低，还有我用primer 5设计引物，下面的4个选项，发卡环和二聚体、错配等，应该优先考虑不用哪个啊，我设计的引物几乎这几项都有

• hyuu (2015-8-03 10:25:00)

  
  我今天做PCR，发现只有在54度退火温度以下，才出产物，高的温度根本不出产物，我的引物GC含量差的比较大，而且还有二聚体，错配等，我这个基因太难设计了，我要被逼疯了
  大家帮帮我，快快快CryCry

• ztonyc (2015-8-03 10:26:00)

  
  你好，原先的引物再加上酶切位点和保护碱基，P的效率当然有所下降了，不过还是能能P出来的，如果设计引物把发卡环和二聚体、错配等都考虑在内的话，那根本设计不出合适的引物，所以引物设计软件更多的是用来检测你设计的引物存在发卡环和二聚体、错配等，但是不能指望他设计出没有发卡环和二聚体、错配等的引物。而且主要是看你P基因是用来做什么的，如果接着做原核或者真核表达的话，那就严格配对设计引物，不考虑发卡环和二聚体、错配等。
  还有就是54度退火温度以下，才出产物，当然了温度越高，那么特异性也越高所以P不出来的，我建议你做个梯度，温度从低到高做，低温p不出来，高温更p不出来的，如果在54度时没有任何杂带且目的条带很亮，那么就ok了呀，可以接下来做别的了，直接切胶后纯化回收。
  还有就是如果有杂带而且升高退火温度也还有的话，现在是用的普通酶，那差不多条件已经摸好了，可以用高保真酶，建议用takara的高保真酶

• ztonyc (2015-8-03 10:27:32)

  我的目的基因是要转到真核细胞中，进行表达检测，关键是我要扩目的基因的全基因，这个目的基因有3Kb左右，可是我把目的基因放到primer5上进行设计的时候，引物都有二聚体和错配，我设计了半个月了，也没找到没有毛病的引物，我十分郁闷，现在P基因的这个引物，是没加酶切位点的引物（当然也有上面那些毛病），所以我都不敢加酶切位点了，因为现在P出来的效果就很差了，再加酶切位点的后果，不敢想象啊，不过P出来之后，连上载体的问题，也因为没有酶切位点，而问题一堆，真是愁煞我也
  十分感谢你的帮助和支持，感激不尽，呵呵

• 园丁## (2015-8-03 10:28:23)

  把P出来的基因回收后作为模板，再用加过酶切位点的引物P第二轮试试（要是P的条带很弱，回收不了，可以把胶切下来，加点TE震荡一下做模板），要记住，没有完美的引物滴，呵呵。个人观点，欢迎指正，O(∩_∩)O~

• hyuu (2015-8-03 10:28:55)

  
  呵呵，还有这种方法，这是什么原理?我研究一下，十分感谢，给我黑暗的前途，点了一盏灯

• 33号 (2015-8-03 10:32:56)

  
  你要做真核表达，不能用引物设计软件来设计，需要自己设计，上游引物和起始序列一致，下游引物要和尾端序列互补，如果是全基因序列无需加终止密码子的，在上、下游引物5端加酶切位点和保护碱基。无需考虑有无发夹结构、错配等。
  注意：引物设计软件可用来分析和检测你的引物有无发夹结构或错配，如果用它来设计真核表达的目的基因是不行的，如果把所有的引物设计原则统统考虑在内的话，根本设计不出你所需要的引物，也没有那么完美的引物。

• 33号 (2015-8-03 10:37:19)

  
  可采取楼上 明天的影子 的建议，你克隆3kb，本身就很难，所以建议用高保真酶，一般takara公司的好些。

• dog002 (2015-8-03 10:38:16)

  
  忽然想起来，楼主的基因里有没有什么酶切位点？ 原则上，这类位点要避免被设计入引物中。

• hyuu (2015-8-03 10:38:42)

  
  谢谢大家的帮助，我也是刚刚知道基因里有酶切位点的，并且查了一下，
  你要做真核表达，不能用引物设计软件来设计，需要自己设计，上游引物和起始序列一致，下游引物要和尾端序列互补
  这是什么意思？这是怎么设计的？为什么做真核表达，就得这么设计引物呢？？
  怎么这么复杂啊，我的毕业啊！！！！！
  大家帮帮我吧

• remonte (2015-8-03 10:39:03)

  
  因为你要做表达,需要完整的阅读框,也就是从起始密码子到终止密码子全部序列,所以 上游引物和起始序列一致，下游引物要和尾端序列互补.
  你的载体应该还有其他的酶切位点,可以选择你的基因片段没有的酶切位点,加到引物序列上.然后再连到载体上.
  没有那么难的,呵呵 努力吧!

• veiwu (2015-8-03 10:39:40)

  
  如果不设计酶切位点的话，可以试下T载体啊！上面有许多酶切位点可以选择的！

• hyuu (2015-8-03 10:41:52)

  谢谢大家，可是我要再问一下，我扩的不是从起始密码子开始扩的，而是从启动子开始扩的，这样阅读框会不会移码啊？？？
  还有这句话 上游引物和起始序列一致，下游引物要和尾端序列互补 还是没理解
  这里的起始序列是从哪儿到哪儿啊 尾端序列是从哪儿到哪儿啊
  我对不起大家，大家忍耐点啊

• DCS (2015-8-03 10:43:15)

  
  通常是直接扩增ORF的，而载体上通常有启动子，不需要从基因的启动子开始扩增。
  是否移码要跟选择的载体对着看。
  “上游引物和起始序列一致，下游引物要和尾端序列互补”应该指的是巢式PCR的内侧引物，因为要扩增的片段就是整个ORF，所以引物就是两端序列了。

• hyuu (2015-8-03 10:45:59)

  
  谢谢楼上的关爱，
  这个通常是直接扩增ORF的，是怎么扩的，是从起始密码子（ATG）开始扩的吗？是扩的DNA还是mRNA
  还有 是否移码要跟选择的载体对着看 这个是什么意思 怎么看
  谢谢大家，让大家操心了

• baidukk (2015-8-03 10:48:02)

  好贴，关注。偶最近也在学习怎么用引物设计软件，郁闷，本科没学过，现在研究生自学，看不懂呀！！