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【讨论帖】蛋白胶内消化及质谱分析集中讨论
从2D胶上挖下的点不少，可是就是无法得到理想的质谱结果，真是让人苦恼，各位做蛋白质组的同道，一起讨论一下，把您的经验和遇到的问题以及解决方案给大家介绍一下。【讨论帖】蛋白胶内消化及质谱分析集中讨论
先在此提出一些问题
1，待作质谱分析的PAGE胶保存方法。
2，4度保存的PAGE胶半年时间（或其它时间）后还可以做质谱分析吗？
3，手工切胶时使用的工具。我是用注射器把针头前端磨平，然后硅烷化。
4，切胶后是否一定需要切成1mm3的小块，如何切碎？切碎后如果被枪头吸掉如何解决？
5，银染和考染凝胶块的脱色方案。脱色时间，次数，脱色液成分等
6，使用碳酸氢铵缓冲液的浓度，25mM, 50mM, 100mM，经常使用哪个，感觉效果如何？
7，trypsin使用量。是根据胶块大小，还是根据估计蛋白含量，或其它？
8，如何进行消化？
9，是否需要考虑溶胀凝胶用液体的体积？如果是，加trypsin的体积是多少？
10，加trypsin后是否应放4度一段时间，如果是，要多长时间？
11，如果加trypsin的体积太少，是否应补充碳酸氢铵buffer，以使凝胶充分溶胀？
12，消化用溶液的体积是否应该超过凝胶体积？即是否应该使凝胶完全浸没在溶液中？还是只要使凝胶充分溶胀即可，而不需浸没凝胶。
13，消化时间如何掌握？以使消化充分而自切峰少。
14，不同来源酶的效果如何？
15，从消化完的凝胶中抽提肽片段的方案。抽提溶液组成，抽提几次，抽提温度。超生对抽提帮助有多大？
16，抽提溶液抽真空方案。有人建议不要将抽提液完全抽干，是否有意义？因为如果一次抽很多样品，根本无法保证抽的速度完全一致，可能有的已干，而有的还有很多液体。
17，溶解抽干消化产物的方案。溶解液组成，加入量。如果作MALDI，是否可以将matrix solution直接加入抽干产物中。如果是作ESI，溶解液中使用TFA，而LC用溶液中使用甲酸，是否会对结果有影响？
18，MALDI点靶方案。
好了，暂时只想到这么多。各位同道可以针对以上问题提出自己的解决方案，也可以把自己的经验教训告诉大家，或者提出自己的问题。
谢谢丁香园提供这个空间，使我们能在此共同学习提高。
补充：可以检测到的蛋白量范围是多少？是否考染可以看到的点都可以质谱鉴定出来？银染点鉴定效果如何？
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【讨论帖】蛋白胶内消化及质谱分析集中讨论
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最新回复
utt0989 (2013-8-17 11:00:32)
是因为群里做蛋白质组的人不太多，还是各位不愿把自己的经验与大家分享，或者是近期内做蛋白质组的人不常来。
我先来个抛砖引玉吧。把我一些不成熟的做法给大家看看，肯定有很多疏漏之处以及有待改进的地方，请大家多提宝贵意见。
1，我一般是把染好的胶用水洗几遍，然后用保鲜膜包起来，放于4C。
2，我大多数胶点的质谱做得都不好，但有一次一个保存半年左右的样品竟然作出非常漂亮的ESI二级质谱。
3，切胶成小块很容易被枪头吸走，所以我有时只是将凝胶切成较大块，而不切得太小。
4，使用常规考染脱色方法，银染用铁氰化钾和硫代硫酸钠。但考染脱色特别慢，不知有何高招可以加快。
5，NH4CO3浓度我经常使用25mM，文献中50mM和100mM也常见。Merck的产品介绍中声称可以使用无盐水进行消化。
6，我一般根据凝胶大小决定Trypsin使用体积，2－5ul之间。如果凝胶没有充分溶胀，我会再加一些buffer，4C放置后再把多余的液体吸掉（不知是否有必要）。
7，37C消化过夜是我最常用的选择。
8，我只用过Merck的TPCK modified trypsin。现在Merck新出了重组酶，另外Promega的酶经常在文献中看到，但没用过；好像现在Sigma也出了测序级胰酶。
dongdongqiang (2013-8-17 11:00:56)
xue258 (2013-8-17 11:02:14)
BOSS2011 (2013-8-17 11:03:25)
Q:4度保存的PAGE胶半年时间（或其它时间）后还可以做质谱分析吗？
A:胶上的蛋白质带只要没有扩散就可以。
Q:手工切胶时使用的工具。我是用注射器把针头前端磨平，然后硅烷化。
A:我是直接用刀片切的带和点。
Q:切胶后是否一定需要切成1mm3的小块，如何切碎？切碎后如果被枪头吸掉如何解决？
A:不一定要切成这样，我们的目的是使脱色干净，胶内蛋白尽可能被酶切。
Q:银染和考染凝胶块的脱色方案。脱色时间，次数，脱色液成分等
A:银染，3％H2O2/25mM NH4HCO3/H2O,时间15－20MIN,加水中止反应，加
100％ACN 10min，然后冻干。个人觉得比铁氰化钾和硫代硫酸钠好。
考染，100mM NH4HCO3/30％ ACN,脱色干净。加100％ACN 10min，然后冻干。
Q:trypsin使用量。是根据胶块大小，还是根据估计蛋白含量，或其它？
A:看蛋白的量而定。一般为1:20，我觉得较理想。
Q:加trypsin后是否应放4度一段时间，如果是，要多长时间？
A:放4度是为了让酶尽量进入胶内，与蛋白充分接触。一般为1个小时。
Q:可以检测到的蛋白量范围是多少？是否考染可以看到的点都可以质谱鉴定出来？银染点鉴定效果如何？
A:这得看你使用哪种质谱，MALDI-TOF的灵敏度较高，而ESI的分辨率较高。现在质谱种类很多，各种质谱可以进行串连，产生了灵敏度和分辨率都比较理想的质谱，如Q－TOF.银染的小点用MALDI-TOF较好，考染的点用LC-MS/MS鉴定的蛋白较准确。
暂时这么多，下次再说。
tangxin_80 (2013-8-17 11:03:52)
我也要做质谱。想请以下试剂用哪个公司最好：胰蛋白酶 乙腈 DTT 碘乙酰铵 碳酸氢铵 甲酸 TFA
另外，做ESI-LC/MS用什么型号的柱子？请高人指教
utt0989 (2013-8-17 11:08:05)
银染用H2O2脱色，会不会因为其氧化作用导致肽片段上的氨基酸残基被氧化，因为H2O2的氧化能力还是挺强的。
您认为H2O2更好是个人习惯，还是有具体的原因？
Q:trypsin使用量。是根据胶块大小，还是根据估计蛋白含量，或其它？
A:看蛋白的量而定。一般为1:20，我觉得较理想。
如何对切下胶块进行定量？在有大量样品的情况下，每个样品都要分别对待，加不同量trypsin吗？
胶块大小和蛋白量不一定成比例，比如要使一个胶块充分溶胀要加10uL溶液，可是只要2ul trypsin（根据比例）。这时是否只加2ul trypsin，还是加完trypsin后再补充8ul buffer？如果要补充buffer，是等4C放置以吸收trypsin后再加，还是直接加入，然后4C放置？
utt0989 (2013-8-17 11:08:23)
我也要做质谱。想请以下试剂用哪个公司最好：胰蛋白酶 乙腈 DTT 碘乙酰铵 碳酸氢铵 甲酸 TFA
另外，做ESI-LC/MS用什么型号的柱子？请高人指教
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普通化学试剂可以选用Sigma公司，
胰酶可从Roche或Promega获得，乙腈要用HPLC级，甲酸、TFA、NH4CO3我用Sigma的，DTT是Sigma、iodoacetylamide最早用Sigma的，现在我用acros的。ESI-LC/MS用HPLC柱子，联系质谱时他们会提供，一根柱子上万元，只做几个样品没必要买。
tangxin_80 (2013-8-17 11:10:52)
utt0989 (2013-8-17 11:14:59)
不客气，以后多交流，目前国内做这方面的人还不多，有很多问题找不到人讨论，很是郁闷。老板对这方面也不懂，无法指导，只好自己摸索。不知你那边如何？我在北京，你是在哪儿？以后有机会多聊聊。
yjf1026 (2013-8-17 11:15:22)
蛋白质经酶解后的分子量范围是多少？
据agilent的资料，粒径300A的柱子适合做大于4KD的肽段，80A的适合做小于4KD的肽段。但是他们的其它资料中，做质谱时用的柱子是zorbax sb300(粒径是300A）。难道酶解后的肽段大于4KD？
mysmdbl (2013-8-17 11:17:45)
pengkp,使用H2O2脱色时，时间不要太长，浓度不要太高。另外它的氧化也毕竟有限，对于后面的酶切来说，影响不会太大。而且H2O2脱色不会使样品的盐浓度增加，这是它的一个优点。
98776langtao (2013-8-17 11:21:13)
我现在也在做质谱，碰到好些问题，想到外面去学一下，不知道有哪位知道哪里的质谱技术比较好，我听说是湖南师大，只是觉得那里离太远，郁闷中。
loli (2013-8-17 11:22:35)
2D胶干燥若干年后仍有人把点打出来。若近期不打，较之4度保存，干胶保真度为佳。原则是蛋白不变质。
orangecake (2013-8-17 11:23:50)
有没有用SELDI做过肽谱的?
tangxin_80 (2013-8-17 11:25:10)
刚摸索了２DE，正准备下一步的质谱分析，来这里收获颇丰，感谢！
请问西南地区哪有MALDI-TOF？
gogo (2013-8-17 11:25:41)
请教各位：胶内酶切对试剂要求那么高，那么考染时是不是也需要优质的试剂呢？我想做colloida coomassie brilliant blue染色，请问那些甲醇、正磷酸、硫酸胺是不是也要订sigma的？
gemei0115 (2013-8-17 15:20:41)
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国产分析纯
3N4G (2013-8-17 15:21:15)
胰酶可从Roche或Promega获得，乙腈要用HPLC级，甲酸、TFA、NH4CO3我用Sigma的，DTT是Sigma、iodoacetylamide最早用Sigma的，现在我用acros的。ESI-LC/MS用HPLC柱子，联系质谱时他们会提供，一根柱子上万元，只做几个样品没必要买。
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我也打算自己做胶内酶切，目前正准备订试剂，想进一步请教：甲酸、TFA、NH4CO3、DTT、IAA、CaCl2这些是否都需要最高纯度的，因为我发现即使是sigma的产品，同样的产品种类也有很多，还有溶于 不同溶剂的，而且价格相差很大，正发愁到底该订哪一种，请高手再给详细一点的指点，谢谢！（不好意思，本人比较愚钝）
再说具体一点，比如anhydrous TFA，有peptide mapping用的，100g $60.8，proteinsequencing用的，40ml $132.6，都是liquid，density1.49g/ml, distilled from chromium oxide under nitrogen, treated with aluminum oxide, then redistilled rom dithiothreitol under nitrogen,前者标了纯度99＋％，后者没标，为什么都是液体一个单位是g，一个用ml呢？到底该订哪种呢？
还有，NH4CO3就用minimum 99.0％的可以不可以，还是BioChemika Ultra >99.5% ,或者puriss. meets analytical specification ，99-101%，还是 purum p.a. >99.0%
nut6694 (2013-8-17 15:22:11)
刚到，有几个问题有点看法：
* trypsin使用量。是根据胶块大小，还是根据估计蛋白含量。
应该将胶颗粒（还是1立方mm为佳，要不影响脱色和消化的）覆盖，TRYPSIN应是过量的。
*银染用H2O2脱色，时间不要太长，浓度不要太高。
似乎氧化是值得考虑的问题。对不同样本（蛋白质分子），时间、浓度难掌握，分子的基团受氧化程度不一，对后面的鉴定分析有影响。有不用H2O2的方法供选择。
*2D胶干燥若干年后
若干年倒不是问题，问题是你要分析的目标蛋白质有无受影响。另可加甘油保存蛋白质样品（液态或干胶时）
*有没有用SELDI做过肽谱的?
一年前的信息，SELDI后面的MALDI还不能做肽谱，现在是否该公司有新的仪器（能做肽谱）？？那位有信息？
*若手工操作，污染很头痛的，银染时的KERATIN防不胜防，各位注意啊
*总的说，我们刚起步。2D电泳除了高通量和好看外，其工作强度/难度和灵敏度是瓶颈。许多重要的蛋白质在2D上看不到。
谢了，欢迎大家指正
uaubc (2013-8-17 15:27:11)
【讨论帖】蛋白胶内消化及质谱分析集中讨论