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【求助】GAPDH

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-4-16 15:24    作者: bohe221    来源: 分析测试百科网

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大家一般作gapdh的时候怎么用，是不是先做抗体检测，然后作gapdh，之后重新跑胶，检测抗体？
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  • DNA (2014-4-16 15:25:26)


    你是指的是做western-blot吗？你对做western的整个流程是不是还不是很熟悉。内参都加进去 用TBST洗10min，3次。接着压片就可以了。为什么还要跑胶？GAPDH如果是HRP(辣根过氧化酶标记的可以同二抗一起孵育的

  • bohe221 (2014-4-16 15:25:48)

    是的， Western blot. 我们这里做的时候相当于GAPDH也是一个抗体，单独做一个压片，针对结果调整上样量。既然要调整，难道不需要重新点样电泳吗？

  • wood533 (2014-4-16 15:26:08)

    哦，我明白你的意思了。
    你的意思是根据前一次的内参结果来确定下一次的上样量，
    这怎么具体确定上样量啊？！WB本身就是半定量的，不能具体到数值。
    上样要看蛋白浓度的，先严格蛋白浓度测定，确定样本上样总量一致，
    其次在同一张膜上做内参，各样本的目的蛋白与内参做ratio，校正上样过程中的误差，比如加样的时候漏了好多等等，而且，蛋白浓度测定有时侯也不那么准确的

  • bohe221 (2014-4-16 15:26:27)


    我们怎么是通过内参来掌握各样本之间蛋白浓度的差异，然后调整样本的上样量使蛋白浓度一致啊　最开始上样的蛋白量因组织不同肯定有差异，怎么能做到内参就跑得一致呢？

  • uaubc (2014-4-16 15:26:45)


    我也要开始这个实验了
    也听过要用内参来确定蛋白的上样量 但就不知道怎么来操作
    请各位高手 具体的指点指点
    谢谢
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