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【讨论帖】运用崭新生物技术开发天然药物
运用崭新生物技术开发天然药物【讨论帖】运用崭新生物技术开发天然药物
一.前言
人类长期以来利用天然药物防病治病，至今世界上许多国家和地区的人民仍然将天然药物作为防病治病的重要手段。中药是我国医药宝库的重要组成部分，也是我们人民数千年来同疾病作斗争的武器，药用植物防治疾病的物质基础在于其中的有效成分，但植物中天然活性成分往往含量很低，如紫杉醇、三尖杉酯碱、喜树碱、人参皂苷Rh2等含量在万分之几或更低。还有天然药用植物资源有限，随着天然药物开发利用趋势日益增多，野生资源被大量消耗，有些中药资源丧失了适宜的生存环境，甚至衰退或濒临灭绝。进行中药资源的化学、生物技术、药理学和制剂学等研究，是保证中药资源持续利用和中药产业可持续发展的有效途径之一。
50多年来我国以中草药为原料开发出了40多种特有新药，如黄连素、四氢巴马汀、东莨菪碱、莨菪碱、天麻素、草乌甲素、蒿甲醚及丹参酮等。而青蒿素是国内自主开发的中药抗疟物质。
发达国家在研制化学合成药物方面保持领先的同时，对中草药和各国传统医药正在加紧研究。而世界各新药创制工作者仍在继续积极开展研究，续紫杉醇之后，又将掀起新类型有效成分的研究热潮，研究水平不断提高，多由化学基础研究转向应用研究发展。其特点是化学与活性紧密结合，加大筛选力度，以数量保质量，主要寻求一些治疗重要疾病（如肿瘤、艾滋病、心脑血管疾病、神经系统疾病和免疫性疾病等）的有效成分。
二.原理
今天我们开创了一崭新生物技术，它是集成于微生物生态学技术、发酵技术和组合生物转化技术。菌种是一个群落，它是从某一开花植物中分离出来的微生物群落，其中有丝状真菌、细菌等。它也是一顶级的微生物群落。该生物技术的工艺简单，易调控和操作，能耗低。这一群落（即菌种）不仅适合开发天然植物药物，而且还适用于开发一些天然昆虫（蛹、幼虫）的药物。
生物发酵过程是一种复杂的多尺度时变系统，传统技术方法很难对此展开深入系统的研究，还原论方法解析了微生物大量功能基因的作用，但对发酵过程中全域性研究无能为力。需要新的认识论和方法论。就植物内生菌发酵法生产天然药物而言，其一是宿主植物与其内生真菌之间可能存在一种在两种生物体内遗传交换的分子机制，即基因与基因之间相互交换。内生真菌生存在一个竞争的环境中，例如，红豆杉属的内生真菌可以通过生产和耐受紫杉醇，保证自己的竞争优势。紫杉醇与内生真菌之间的相互关系，极可能是过去宿主植物与内生真菌长期协同进化的结果，今天我们很难再重演那过去进化的历程（进化认识论）。其二是在药用植物内生菌发酵法生产天然药物时，一方面内生菌脱离植物体后，往往次生代谢停止或延缓；另一方面内生菌在自生和共生条件下代谢途径会有所差异。其三是单个内生菌的发酵不构成真正的生态系统，没有物种流，没有多种种群的协调效应，环境的变化以及干扰在细胞的表型特征上反映单一、被动，使发酵过程优化和菌种改良很难协调统一。因此用植物内生菌发酵法生产天然药物有必要加入一些新内涵即真正的生态系统，也就是加入的菌种是一顶级的植物内生微生物群落。该群落在水溶液的密封（即缺氧）发酵反应器中，将新鲜的植物材料当作宿主，群落（菌种）能迅速的侵染进入宿主的组织和细胞中，并在短期内形成共生关系，同时进行发酵。共生过程使群落中的种群之间进行基因交换以及种群与宿主植物细胞进行基因交换。在种群的协调下，使群落中的各种群进行基因重组，并构建产次生代谢产物的代谢途径以及相关的酶类。由此使菌种得到改良，从而使改良菌种满足了包括环境条件影响在内的整个生物加工过程优化的需要。同时，群落与宿主植物材料的共生关系（也可以说是发酵过程）中，实际上是具有不同催化功能的多个种群催化体系（整个细胞）结合起来，通过多步生物转化反应，生成大量取代方式各异的转化产物。并且能使相当一部分转化产物从原来难溶于水或不溶于水转变为易溶于水，或者转化产物经转化后大大增加其水溶性，这样也就增加了药物有效成分的生物利用度。
三. 具体流程和操作：
1.紫杉醇
（1）选择新鲜的紫杉醇含量高的红豆杉材料作为诱导物，或者称为引物；
（2）运用上述群落菌种，在水溶液中，在（缺氧）密封的发酵罐中对红豆杉进行发酵，菌种对红豆杉进行侵染，并建立共生关系，时间3~5d；
（3）第二次投放菌种，进行相应的基因表达，通过相应的代谢途径，合成目标产物；
（4）在第二次投放菌种后，紧接着，添加合成紫杉醇的前体物质，或添加真菌调节剂，其目的就是提高紫杉醇的产量；
（3）和（4）持续时间为7~10d，即完成发酵；
（5）发酵液经二次过滤处理，即可进入下游提取、纯化工艺；
（6）用有机溶剂提取法对过滤液进行提纯，最后制备成紫杉醇粗品。
以前一次的部分发酵液为菌种源，在每次分批发酵时，投放极少的红豆杉材料当作引物，以及投放一定量的没有改良的原内生微生物群落（菌种）即可。
其实用微生物发酵来制备天然药物有两个关键点，关系到目标产物的产量和提纯。其一是菌种的选取，一个好的菌种能使整个合成过程事半功倍。这是一项需要花大量的时间和精力来进行的伟大事业。其二是提取和纯化的方法，可以通过实验进行优化。今天我向贵公司提出的项目，就是已经选择好了菌种，以及菌种改良的方法和发酵流程及操作。后面只要进行实验验证、评估，最后优化发酵过程以及目标产物提取和纯化的方法。一般不需要进行中试。其原因如下：将微生物技术从实验室研究到工业应用的过程是还有相当的距离，这其中主要有两个科学挑战，一是通常是由一个菌株获得的研究结果，尤其是实验室的典型菌株，然而工业上需求大量的菌株，多种培养条件和培养基；二是对于遗传改良的菌株可能使用于实验室的证明，但是很少用于有目的的释放到环境中，而我们使用的崭新生物技术，其菌种的顶级的植物内生微生物群落，菌种（群落）在生物反应器中，将新鲜植物的外植体当作宿主植物来看待，在缺氧条件下，侵染进入外植体的组织和细胞中，通过改良自身，与外植体互惠共生，使生物反应器成为一个真正的生态系统。因此，菌种能根据工业规模的变化，改良自身 ，用于有目的的释放到工业生产的发酵罐中，从而获得目标产物。
2.人参皂苷的提取流程
（1）选择适量人参材料作为被提取的物质；
（2）运用上述群落（菌种）在水溶液中，在密封（缺氧）条件下，对人参材料进行发酵，时间3~4d；
（3）除去发酵液，留下人参发酵渣，在无菌室中进行浅盘固体有氧发酵，时间5~7d，即得菌基；
（4）对菌基进行提取，用水-醇提取法，后经纯化，制备得到粗人参皂苷Rh2等含量大大提高，甚至比原来提高4~8倍。
3.动物昆虫（蛹、幼虫）的提取天然药物
（1）选择有药用的昆虫（蛹、幼虫），对昆虫进行预处理，即将昆虫放入密闭容器内加热至摄氏35度~摄氏45度，即可；
（2）这样就可以把昆虫当作植物材料来进行上述同样的发酵，即在水中进行缺氧发酵时间3~5d；
（3）除去发酵液，将昆虫放入浅盘中，在无菌室中进行固体有氧发酵7~10d，即获得菌基；
（4）对菌基进行提取和纯化，得到天然昆虫药物粗制品。
上述提取方法是将发酵技术与组合生物转化技术有机结合的典范。
四.结尾
寻求有实力的公司且对上述项目感兴趣，请与我联系。
广西师范大学 苏林
邮箱：linsushing@yahoo.com.cn
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【讨论帖】运用崭新生物技术开发天然药物
【讨论帖】运用崭新生物技术开发天然药物
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最新回复
dior (2015-1-17 16:15:23)
有些人对此帖子的内容持怀疑和否定的态度。下面我就此帖子的有关问题进行注释。
在长期的实验和生产实际中，人们不断地发现很多重要生化过程是单株微生物不能完成或只能微弱地进行的，必须依靠两种或多种微生物共同培养完成。微生物虽然微生物混合培养在很多领域中的作用已得到充分肯定，部分成果已成功应用于实际，但对大多混合菌体系中菌间相互关系和作用机制的研究尚不够深入。因此，目前对于具有协同作用关系的菌株筛选和组合还是一个随机过程 ，缺乏有效的理论指导，而且对于已经应用的混合培养体系也不能有效地协同菌间关系，使其达到最佳生态水平，发挥最大效应。这严重阻碍了混合菌培养的发展和应用。因此，如果从生理代谢和遗传角度对混合菌间关系和协同作用机制进行深入研究，对混合菌培养的理论和应用都将有巨大的突破。随着混合菌培养在各方面应用研究的深入，人们不再满足于传统的反应模式，已开始引入一些新兴的生物工程技术，使该领域的研究更具有活力。如，，利用细胞融合技术和基因工程技术，由具有互生或共生关系的微生物构建工程菌，看使工程菌既具有混合培养的功能，又拥有纯培养菌株营养要求单一，生理代谢稳定，易于调控鞥优点，也是极有前景的研究方向。
上世纪中、后期有些生物技术科研工作者就开始关注复合（组合）微生物发酵技术的研究，随着分子生物学、遗传学、基因工程、酶工程和发酵技术的快速发展，逐步了解一些组合微生物中不同种群之间的共生关系的营养需求的互补性以及代谢的时序性。而在基因水平上，探索了组合生物催化和组合生物合成，这些都是近几年形成的一种新的研究思路。
组合生物催化是将具有不同催化功能的多个催化体系（包括酶和整体细胞）结合起来，通过多步生物转化反应，生成大量取代方式各异的转化产物。即形成分子多样性；或是利用催化酶比较宽泛的底物特异性，同时催化多种底物发生类似的化学反应。虽然组合生物催化只是最近才加入到合成化学的领域中，但是它在自然界可能已经存在了几百万年，自然界通过不同的酶来催化大量的反应，从而合成非平行的结构复杂的生物分子。
组合生物合成是在基因水平上结合不同物种的代谢途径的一种方法。药用植物中次生代谢途径在两种（即大肠杆菌和酿酒酵母）微生物中往往并不存在，或者不完全存在，两种微生物中也有所不同。因此要用这两种微生物进行代谢调控，通常需要将一整条合成途径或者一部分连续的合成途径全部转入微生物中进行表达，这既是应用这两种微生物作为组合生物合成的载体时的主要思路，但是限制这一技术应用的主要原因，是因为很多化合物的生物合成途径不是完全清楚，相关的基因还没有完全找到。什么办？我认为以某植物内生的、顶级的微生物群落作为组合生物合成的载体来解决上述问题。植物内生的、顶级的微生物群落是一个成熟的、稳定的微生物群落，群落中种群间的生物催化、生物合成往往具有协同效应。从而能对植物次生代谢进行调控，是因为群落能将发酵技术、组合生物催化和组成生物合成等技术的天然内部联系紧密结合起来，通过共生关系，帮助我们建立异源表达的“超级”宿主-载体系统，并在整体协调的生物合成上产生结构复杂的、有活性的天然药物。且以此为手段实现工业化生产活性天然药物。由上述可知，发现了某植物内生的、顶级的微生物群落，对推动生物技术的发展具有极其重大意义。
我国有一种独特的生产工艺，过去常被称为固体发酵，最早在2500年前已采用农副产品如麦麸等和中药如青蒿等混合，自然生长酵母菌等，最后制成著名中药“神曲”，沿用至今，但此后长期以来并无发展。中药的“神曲”采用新鲜药材经酵母菌等自然发酵而成；虫草是蝙蝠娥幼虫经虫草菌感染发酵而成；僵蚕是家蚕经白僵菌感染发酵而成，还有半夏曲、沉香曲等。这些经典药物是经微生物发酵后产生新的药物活性，其中虫草是非常名贵的中药。
随着生物技术快速发展，为了最大限度的发挥微生物在药物中的潜在效能。根据我发现的某植物内生的、顶级的微生物群落的特性，使这一群落在特定环境条件下能迅速侵染到药用植物的外植体的组织和细胞中，同时进行发酵，与外植体形成共生关系，在群落与外植体的相互作用中群落进行自身改良，从而获得产药用植物有效成分的代谢途径。用这样改良菌种对家蚕进行上述同样的侵染和发酵（固体发酵），制备出产药用植物有效成分的药用“蚕”来。甚至再加上组合生物催化和组合生物合成，还会形成丰富多样的次生代谢产物以及新的化合物。
因此，通过运用这种崭新生物技术开发各式各样的天然药物以及炮制的中药，一方面，可以比一般的物理或化学的炮制中药的手段更大幅度地改变药性，提高疗效，降低毒副作用，扩大适应症；另一方面，不仅可以保护和增殖濒危珍稀中药材，大量生产高品质的地道药材和药用活性成分，提高药材活性成分的含量，而且可以控制中药产品的质量，更好地阐明药效物质基础。
总之，利用这一崭新生物技术开发天然药物以及炮制中药都具有广阔的发展前景。云南省微生物研究所和南京中医学院在微生物发酵中药方面已经取得了一定的成果和进展。可以预见，通过努力，运用崭新生物技术可开发出更多有活性的天然药物。利用崭新生物技术发酵中药必将对扩大中药治疗范围、剂型改进，创制新药方面提供新的技术手段，为中药吸取现代科技成果提供新途径，给中药开发注入新的活力，为中药走向世界，造福全人类起着进一步的推动作用。
hustwb (2015-1-17 16:25:06)
baidukk (2015-1-17 16:25:47)
join (2015-1-17 16:26:32)
纯理论的，就如一楼的文字，在这没多少人信的，比较适合到社区去给大爷大妈讲。
cuturl('http://www.paper.edu.cn/')， 在这上发论文很方便的。
windy+++ (2015-1-17 16:26:51)
baidukk (2015-1-17 16:27:17)
dior (2015-1-17 16:29:33)
二楼，有时是实践先于理论。
三楼，没有认真阅读此帖子，该技术使用的是顶级的内生微生物群落，根据群落特性，在特定环境条件下，群落（菌种）侵染植物的外植体的组织和细胞内，将外植体当作宿主，建立共生关系。在共生关系下，构建该工程菌（即群落在共生下进行改良）。并且获得产紫杉醇的本领。每次分批发酵时，需要投放极少量的红豆杉的树枝材料作为诱导物。因为所用的菌种是群落，无论是在代谢上，还是在生物催化上都有种群的协调效应。
dior (2015-1-17 16:31:20)
dior (2015-1-17 16:31:56)
dior (2015-1-17 16:32:21)
其一是：崭新生物技术是位于生态系统层次上的技术，它善于对复杂性、系统性较强的生物体进行处理，如，天然新鲜的香料植物、天然新鲜的药用植物。而其他原来的生物技术是位于基础学科（如微生物学、动物学和植物学）系统的层次上的技术。
其二是：崭新生物技术对植物的外植体进行处理时开始时是与植物的外植体形成共生关系。发酵系统实际上是一个封闭的生态系统，菌种为了适应新的 “生态系统”而进行自身的改良，改良过程在工程上可以说也是一个工程菌的构建过程。
其三是：崭新生物技术是“原生态”的，在整个工程过程中没有人工添加任何一点有机的或无机的培养基成分，这在其他生物技术是不可想象的、不可思议的。对一般生物技术人员来说，它是生物技术的特例或例外，因此崭新生物技术具有特殊的生物技术意义。
dior (2015-1-17 16:32:46)
dreaming (2015-1-17 16:33:15)
发酵工程中的微生物生态学技术
生物发酵工程是一种复杂的多尺度时变系统，传统技术方法很难对此展开深入、系统的研究。还原论方法解析了微生物大量功能基因的作用，但对发酵过程中全基因组调控网络及培养环境效应的相互影响的全域性研究无能为力，需要新的认识论和方法论。组学研究和系统生物学方法为此提供了一种可能。
因为一个生物系统并不仅仅是一些基因和蛋白质的集合，它的功能也不能通过简单绘出蛋白质和基因的相互关系图而被完全理解。还需要考虑把生物系统作为一个整体来研究它的功能和行为，同时必须分析环境对生物系统内部调控网络的作用机制。
有些发酵工程的前辈认为：“对于微生物工业发酵反应器体系，微生物及其外在环境构成一种相对封闭的生态系统，在这种生态系统中，微生物内在的生理活动、微生物之间的相互作用、微生物与外在环境相互作用关系的研究必须采用系统生物技术的研究方法。”这种想法、思路、方向是正确的，但有些牵强附会，与发酵实际有一定差距。因为生态系统是指在一定空间范围内，由生物群落与其环境所组成，具有一定格局，借助于功能流（物种流、能量流、物质流、信息流进而价值流）而形成的稳定系统。以及在20世纪80年代Odum提出的一个开放的生态系统模型，即，生态系统=输入、环境+系统+输出、环境。单一微生物种群的发酵不构成生态系统，没有物种流，没有多种物种的协同效应，而环境的变化和干扰在细胞的表型特征上反映单一、被动，发酵过程优化和菌种改良很难协调统一。如，产黄青霉就是一个例子。
因此，对生物发酵工程的研究有必要加入一些新内涵——真正生态系统，即加入的菌种为某种稳定的微生物群落，把这样的微生物发酵反应器体系作为真正的生态系统，用系统生物学的方法来研究微生物内在的生理活动，不同种群（微生物）之间的相互作用（重点是协同作用）、种群和群落与外在环境相互作用的关系。起最大特点是全域性研究，特别是全基因组基因表达的时序及环境适用性、适应性的研究，蛋白质组的时序及环境适用性研究，代谢组的时序及环境适用性。以这种系统的观点来研究生物科学的思想由来已久。系统研究有四个特点，其中系统动力学分析：在不同环境、不同条件下，系统的行为变化的研究。高效的菌种（群落）和过程优化，由环境、种群之间基因流决定了群落的表型特征，群落的性质不仅与各个种群的基因组密切相关，也与群落的结构、稳定性以及环境条件（营养种类及浓度、PH、温度等等）密切相关。在菌种改良过程中极可能由群落的自组织体系，根据实际的微观和宏观环境条件对菌种内在的转录组、蛋白质组和代谢组进行调控，统一菌种改良和过程优化。从而使得到的菌种满足包括环境条件影响在内的整个生物加工过程优化的需要。
是否存在这样稳定的微生物群落，答案是肯定的。本人从某一单子叶植物中分离出一微生物群落，该群落是由某种真菌、细菌、原生动物组成。这一群落与宿主植物经长期共同进化，演替成顶级期的群落，因此群落是成熟的、稳定的，群落中的种群之间的效应往往是协同的。在实际发酵过程中，我们还原了菌种的部分的演替环境，即缺氧环境，调动菌种回忆起过去与宿主的协同进化历程，成就了今天的缺氧发酵系统，即就是将新鲜的植物外植体投放进发酵罐中，再加入蒸馏水和菌种，密封发酵罐，而进行缺氧发酵，这时菌种（群落）充分发挥原有的本能而侵染植物外植体，与其形成共生关系。同时这样的发酵系统是密封的生态系统，菌种为适应这一新的生态系统而进行自身改良。菌种经改良获得了产生宿主的次生代谢物的本领，并且自身的基因也参与了重组，还能产生一些新的化合物，相当部分为手性化合物。这样通过发酵过程获得了目标产物。目标产物大于原来的外植体的次生代谢产物。总之目标产物的产量提高了很多。
131415 (2015-1-17 16:33:42)
用微生物对药用植物提取物或者天然产物进行生物转化，的确是发现新化合物的好方法。药用植物内生菌也是筛选活性天然产物的办法，很多药用植物里内生菌与次生代谢产物的合成有密切关系。药用真菌的人工培养也听说过很多，比如楼主提到的虫草在家蚕中的应用，去过一个博览会，就看到了他们这样开发的产品。不过没有买来比较比较含量什么的，但是应该也是一个方法。但是这些试验都是听说，自己没做过，貌似很有前景，也看过不少文章，课题，报告。楼主加油。呵呵
loli (2015-1-17 16:34:03)
dior (2015-1-17 16:34:44)
用崭新生物技术对珍稀名贵中药人参的二次开发——人参蚕
一些珍稀名贵的中药资源有限，而且其天然活性成分往往含量很低，其有效成分的浓缩物产量有限，远远满足不了市场需要。如人参果总皂苷的浓缩物制剂，商品名：振源胶囊等。在这种情况下，只能运用创新生物技术来对中药进行第二次开发，那就是要充分发挥微生物、以及群落（在生态系统层次）在天然药物的潜能。具体开发思路为：以一植物内生的、顶级的微生物群落为菌种，用人参为引物，在密封的发酵罐中进行缺氧的蒸馏水液体发酵，这样的发酵系统就是一个封闭的生态系统，菌种（群落）为适应这一新的生态系统，而进行改良，菌种经改良获得了产与人参相同的次生代谢产物的本领。将这样经过改良的菌种（即工程菌）接种于家蚕上，就能获得产人参总皂苷的蚕的菌质。即人参蚕。其药效甚至胜过天然的人参。正如，青取于蓝，而胜于蓝。
其实我们开发的这一崭新生物技术是集成于微生物生态学技术、发酵技术和组合生物转化技术，菌种是从某一开花植物内分离出的微生物群落，其中有丝状真菌、细菌等。因此它是在生态系统层次上的崭新生物技术，它与原来的生物技术有一些本质的差异。并且该生物技术的工艺简单，易调控和操作，能耗低，投资也不很大。
具体工艺流程：
一.工程菌的构建
以人参为引物，构建能产人参次生代谢产物的工程菌，时间约为7~10d；
二.生产人参蚕
以家蚕作为“外植体”，用上述工程菌对家蚕进行侵染和发酵（固体发酵），生产出含有人参总皂苷的药用蚕菌质；
三.将上述蚕的菌质直接烘干，制备出含有人参总皂苷的人参蚕一味中药。其药效将胜过天然人参。
四.采用现代生物分离、浓缩和精制技术制备出人参总皂苷浓缩物，接着生产出有关人参的药制剂。
研发经费一般为20万左右，其主要经费是将实验样品经权威机构检测，如果样品的人参总皂苷达到开发含量的要求即可。一般中小型企业，就上述工艺流程一、二、三而言，投资约为350~500万元。在原有的厂房和设备下，投资将减少。
其实将上述崭新生物技术还可应用于许多药用植物的开发。如阴香，当有阴香森林，利用从阴香树上落下的叶子，培养一种昆虫的蛹，以这样的蛹为材料，让其蛹被上述微生物群落侵入，来制备出“阴香”虫草。这样的虫草能产生特殊的药效的新的中药产品。其实广西还有一种新的药用植物，它就是“紫板蓝根”其叶子是紫色的，并具有独特的药理和药效。
uaubc (2015-1-17 16:35:08)
lorri (2015-1-17 16:35:28)
dior (2015-1-17 16:35:43)
紫烟 (2015-1-17 16:36:05)
docsy (2015-1-17 16:36:41)
【讨论帖】运用崭新生物技术开发天然药物