【求助】为什么老是有引物二聚体出现给怎么办?


我PCR扩增人基因组DNA的时候,老是有引物二聚体出现.我试着降低引物浓度到0.1(20μM),还是有出现,而且引物二聚体的位置好象还在100-200bp之间,不知道这到底是不是二聚体啊,还是四聚体啊?

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最新回复

  • dior (2015-8-31 17:32:23)


    你这100-200bp的片段不一定是引物二聚体,可能是非特异扩增的小片段条带。你可以引物浓度不变,降低一下褪火温度。
  • bs4665 (2015-8-31 17:42:05)


    你这100-200bp的片段不一定是引物二聚体,可能是非特异扩增的小片段条带。你可以引物浓度不变,降低一下褪火温度。
  • bs4665 (2015-8-31 17:58:39)


    降低退火温度了,那非特异条带不是会更多的,嘛
    而且我也试过。结果没有什么改变啊
  • dhpbj (2015-8-31 17:58:56)


    降低退火温度了,那非特异条带不是会更多的,嘛
    而且我也试过。结果没有什么改变啊
  • zbboom (2015-8-31 17:59:58)


    除了做引物浓度梯度,可以降低一下Mg离子浓度,或者干脆做一个镁离子浓度梯度,降低退火温度肯定是非特异产物更多的
  • S6044 (2015-8-31 18:00:13)


    是不是引物设计的有问题呢?设计好引物后还要对靶基因中潜在的引物进行分析,这些位点应该不会形成同源多聚体结构,也没有明显的形成二能结构的趋势,不会自身互补,与基因组中的其他序列无显著的同源性。你应该先考虑引物自身的问题。如果确认没有问题,再考虑其他原因。
  • youyou99 (2015-8-31 18:00:30)


    引物二聚体的出现是相对的,并不是单纯因为你的条件而导致二聚体的出现,事实上如果引物更倾向于和目的片断结合,正常pcr扩增的话,那引物二聚体就基本不会出现了,换句话说,如果你能扩增出目的条带,那么同样的条件,撤去模板,进行pcr循环就有可能出现引物二聚体。引物二聚体的出现并不可怕,只是说明你的引物不是最佳,但不直接决定能否扩增出来,通常只要引物和目的片断有一定的配对区,摸索合适的pcr条件,应该是能扩增出来的。
    拿我的实验为例,我的目的片断GC含量较高,在未加DMSO之前,怎么优化条件,总是扩不出目的片断,而电泳前端的引物二聚体倒是常常光顾,且亮度挺高,当向体系中加入1.5μl的DMSO后,终于扩出了目的片断,而且二聚体也不攻自破了
  • dhpbj (2015-8-31 18:00:46)


    原因之一:
    引物二聚体的出现太多,说明你的扩增效率不高,也就是说很多引物没有被用来参与PCR的扩增,尤其是目的片段少的情况下,更能用此解释。你可以检查一下你的扩增产物是不是很多。
    单纯依靠降低退火温度,不能解决这一问题,反而会增加非特异扩增的机会。
    建议你先摸索一下退火温度,提高退火温度常可解决问题。
    从你的条带位置看,不像是二聚体,到像是非特异扩增的条带,很可能引物设计的不好,还有另一位置扩增效率更高,因为条带短,更容易扩增出来。
    另外,你用的引物浓度也太高了。正常情况下,终浓度0.1-1uM。
  • zhezhe (2015-8-31 18:01:06)


    建议延长一下退火时间
  • eor (2015-8-31 18:01:46)


    100-200bp应该是非特异的扩增条带
    可以提高退火温度以及降低Mg2+浓度试试
    你没有说除了100-200bp的条带还有没有你要扩增的目的条带?
    比例是多少?
    如果有你要的扩增条带,量还可以
    那没关系呀,把你要的条带切胶继续往后做克隆
    如果没有你要的扩增条带,建议你重新设计引物好了
    有时候你反复摸PCR条件还不如你重新设计合成引物来的快
  • remenb (2015-8-31 18:02:05)

    我也正郁闷着,扩增了一个多月,老是只有100~200BP的带,不知道为何物?我的目标片断在2500BP。正烦着呢!请问楼上是否现在一切顺利!!