【求助】蛋白经镍柱纯化后失活

最新回复

• malong (2016-3-14 13:07:21)

  我不知道你的具体情况，但是因为我的方向涉及到蛋白质折叠和相互作用，所以我怀疑你在洗脱时用凝血酶等切开肽键时可能引起了蛋白质空间构象的改变，这样的改变可能是在你的实验条件下无法逆转，也可能是形成了多聚体之类，或者切割了多余的位点导致蛋白质肽键断裂。我不和讲蛋白质折叠理论与实验技术了，太多。
  你可以先检测一下洗脱的蛋白质的分子量与预期的是不是一样，可以做个电泳或者质谱或者分子筛层析看看。如果没什么变化那就要考虑空间构象了。可以换种切割酶试试，或者构建新的切割位点，再有在(His)6与目的蛋白质之间的肽链大约5-6氨基酸就够，最好是亲水的。可以事先用蛋白质空间构象预测软件模拟一下，不十分准确，参考一下总可以。

• xiaoxiaojinglin (2016-3-14 13:07:44)

  如果蛋白质是多聚体，你可以适当增减PH值或离子强度，一般地可以再次聚合。

• hcy517 (2016-3-14 13:08:07)

  再有，考虑你的蛋白质的过柱后是否是去了关键的辅酶小分子，考虑加回去试试活性。

• PP熊 (2016-3-14 13:08:27)

  没看明白，我的问题是：
  1。你蛋白挂柱后不经任何处理，直接收集的馏分是指蛋白样品加入到柱子里后流出来的液体么？蛋白结合到柱子里了，流出来的液体本来就不应该含有目的蛋白呀。没有蛋白当然也检测不到活性呀。
  2。你后面的洗脱及透析都做了是吧？有没有发现沉淀呢？
  3。还有蛋白对盐浓度敏感么？挂柱子前的cell-free体系是怎样的溶液？洗脱蛋白后，用cell-free体系置换你的洗脱溶液体系，看洗脱蛋白在挂柱前应该有活性的体系里还有没有活性。
  4。挂柱前的蛋白溶液和洗脱后的溶液泡个page胶看看，不加SDS，看看洗脱后的蛋白条带和洗脱前是不是在同一位置。如果是，蛋白就是单体了，如果不是那就考虑是多聚体了，或者是需要一些辅助因子之类的。

• xiaoxiaoai (2016-3-14 13:08:50)

  蛋白样品里目标蛋白的量是很多的，不能100%完全挂到柱子上，所以加样后直接滴出来的样品中肯定有目标蛋白。
  所有检测活性的馏分都跑了SDS-PAGE，目标蛋白的量都很显著。
  透析后，样品一切正常。
  洗脱溶液与cell-free体系相比，所用的pH值等都完全一致，唯一不同的可能就是咪唑的存在。
  正在考虑要不要跑Native胶，看看与未诱导的相比，目标蛋白是单体还是多聚体、

• xgy412 (2016-3-14 13:09:10)

  是的，首先要判断有活性的蛋白是怎样的形式

• danzi (2016-3-14 13:09:33)

  若水这句话提醒我了一件事：可能楼主的蛋白质在纯化过程中发生了去折叠和重折叠，或者发生了一级结构的改变，你可以检测一下。、
  折叠状态的检测最好当然用NMR，不过这里没有必要，楼主可以对有活性的蛋白质及纯化出的蛋白质用同一种蛋白质酶有限水解，做个酶谱分析，就是同样条件下水解后，对两种蛋白质分别走非变性电泳，对比图谱。一级结构的改变，不用酶解，直接过电泳即可检测对比。
  你可以对于纯化的蛋白质变性后，透析除尽变性试剂后复性在测定一下活性。

• 8899 (2016-3-14 13:10:09)

  试试调整破菌条件，可能超声生产的热量可能使GST蛋白变性。