简单两步改善WB中膜蛋白的检测
俄罗斯科学院的研究人员近日开发出一种简单的方法，可改善免疫印迹中膜蛋白的检测。他们在新一期的《BioTechniques》上介绍了这个成果。
利用Western blot，人们可精确鉴定复杂样品中的特定蛋白质。然而，每条泳道可加入的蛋白总量是有限的，这就限制了低丰度蛋白的检测。因此，低丰度蛋白需要预先富集，才能可靠检测。为此，研究人员设计了一种简单方法，从酵母细胞裂解液中富集膜蛋白，并制备SDS凝胶电泳的样品。
为了确定汉逊酵母（Hansenula polymorpha）中膜蛋白Pho87的水平，研究人员一开始用了常规的方法进行样品制备。这就是大家熟知的：用玻璃珠破碎细胞，再用Laemmli SDS凝胶电泳缓冲液煮沸细胞裂解物。尽管每条泳道的上样量相当高，但全长Pho87的条带却总是无处寻觅。相反，Pho87降解产物的条带却格外显眼。
由于Pho87是膜蛋白，研究人员便试着通过分离裂解液中的膜组分来浓缩。他们假设，在细胞破碎过程中提高盐浓度可保护Pho87免于降解，并刺激膜组分沉淀，从而有助于Pho87的富集。基于此，他们尝试了不同浓度的乙酸铵和不同的孵育时间，发现在1 M乙酸铵中孵育2小时可明显改善Pho87的沉降。
大家都知道，样品煮沸可能引起膜蛋白的聚集。同时，样品裂解液中SDS的存在可能使蛋白更容易被蛋白酶水解。事实上，即使蛋白酶抑制剂存在，研究人员还是无法在细胞裂解液中检测到全长的Pho87条带。为了避免煮沸并确保蛋白酶迅速降解，他们采用了包含SDS和高浓度尿素的样品缓冲液。
利用这种方法，研究人员检测了汉逊酵母的一些蛋白，包括Pho87、Sup35、Pmr1、CPY、Gas1、Tpd3和微管蛋白，以及酿酒酵母的一些蛋白，包括Sup35、Sup45、Gas1、Hsp104、Rnq1和微管蛋白，并将实验结果与常规方法进行了比较。
他们发现，与常规方法相比，新方法在膜相关蛋白（Pho87、Pmr1和Gas1）以及Tpd3和微管蛋白上有着更好的表现。Tpd3和微管蛋白的沉淀可能是由于它们与纺锤体极体的相互作用。同时，Tpd3的相当一部分位于细胞核中，这可能也有助于其沉淀。作者认为，将沉淀的蛋白溶解在含尿素的缓冲液中而不煮沸，大大改善了蛋白质的检测，特别是Pho87。
