【求助】western背景太深的问题

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-7-17 10:36 作者: summerxx 来源: 分析测试百科网

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【求助】western背景太深的问题

一抗来自santa cruz 比例为1:600 4度过夜
二抗比例为1:4000 2小时
3%的BSA封闭2小时
上样量60ug

目的条带应该靠近55

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80847421.jpg

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最新回复

summerxx (2013-7-17 10:40:11)

一抗1;600
二抗1:6000
3%BSA+5%牛奶 3小时

84389716.jpg
summerxx (2013-7-17 10:41:08)

一抗1:600
二抗 1:4000
封闭不记得了

29788728.jpg
summerxx (2013-7-17 10:45:33)

一抗 1:1000 3小时
二抗 1:4000 过夜
5%牛奶封闭 3小时

79905766.jpg
summerxx (2013-7-17 10:47:09)

同上是一张膜, 洗脱后1:1800 一抗再次孵育
二抗:1:4000
洗脱后没有用牛奶封闭

50017279.jpg
summerxx (2013-7-17 10:48:47)

每次整个膜都是亮的, 抗体稀释后整个膜也是亮的就是暗一些. 不知道再该怎么办来降低背景. 感觉下面actin的杂带比目的蛋白的带还要深. 希望大虾们救救我,郁闷至极!
wsll (2013-7-17 10:49:07)

你是压片还是扫膜?
summerxx (2013-7-17 10:49:43)

QUOTE:
原帖由 wsll 于 2013-7-17 10:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

你是压片还是扫膜?
是胶片
idea2011 (2013-7-17 10:50:31)

我也出现了这样的情况，不知道怎么办啊！
ukonptp (2013-7-17 10:51:35)

每次整个膜都是亮的, 抗体稀释后整个膜也是亮的就是暗一些. 不知道再该怎么办来降低背景. 感觉下面actin的杂带比目的蛋白的带还要深. 希望大虾们救救我,郁闷至极!

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cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=5936631&sty=1&tpg=1&age=-1')
见１楼　注７，愿对你所帮助
summerxx (2013-7-17 10:54:35)

这个我以前看过我现在处理了封闭,稀释一抗浓度,稀释二抗浓度,还是有背景.还真没试过加大浓度. 不过我大多的膜都很亮很亮,上面的几个片子也就15秒到30秒. 不过我还是会再试试高浓度的..我不理解的是为什么marker也那么亮.
summerxx (2013-7-17 10:54:51)

我觉得我的问题不仅仅是背景深,还有很多的杂带.包括MARKER都暴出来了. 有的杂带比目的蛋白还要深. 片子上的marker
分别是72./ 55/ 43/ 我的目的蛋白,一抗说明书上说分子量是65,有的文献说是58, 但是我做的大多在55处出现条带. 43处出现的杂带有时比55处出现的条带都要深.把膜洗脱后再杂 actin得到的条带和43处出现的杂带很相似.

希望有高人相助.我现在已经是那头什么办法都没有的驴了.(黔驴技穷)
www.1 (2013-7-17 10:57:47)

我欲检测某种大分子量膜蛋白，做了很多次发现始终存在背景过高的问题
今天的实验图如下：
1.

20112849.jpg
www.1 (2013-7-17 10:58:08)

1为actin
2为目的蛋白，约150KD Santc的多抗1：400稀释，4度过夜。

44702515.jpg
www.1 (2013-7-17 10:58:29)

可见背景过深，因为已做了几次，怀疑是抗体质量问题，就用相同的样品同时做了EGFR作为对照。
见下图：
3.

33063237.jpg
www.1 (2013-7-17 10:59:36)

3为actin
4为EGFR 可见同为大分子量的膜蛋白，在相同的条件下，即转膜，封闭，洗膜，二抗均相同，区别就是一抗的不同：图4的背景就非常干净。
我想请教各位：我想除了我的目的蛋白本身在全蛋白裂解液中表达量低以外，这种过高的背景是否是因为抗体本身质量问题所致？
4.

70176268.jpg
abc816 (2013-7-17 11:00:44)

当然，一抗对结果的影响是很大的，否则岂不是每个抗体都可以用相同的条件？
如果你的目的条带很深，只不过背景也比较深，那你可以增加一抗的稀释度，不过，我感觉Santc的抗体用不着稀释很多倍的，效价不是很高，多抗的质量当然比不上单抗，非特异性条带是会有的。
如果目的条带本身就很浅，但背景很深，就是你封闭和洗膜的问题了！
www.1 (2013-7-17 11:01:28)

我做出来的目的条带是很浅的，但背景很深，我上面的实验就是证明了同等的条件下其他蛋白的检测都很好，单单只有目的蛋白的不好。根据你的建议，我只能增加抗体的浓度，原来封闭已经是4度过夜了，洗膜原来是10min*3,再进一步增加？
abc816 (2013-7-17 11:04:10)

我建议你先不要增加抗体的浓度，而增加你的上样量来使目的条带深一些。用TBST洗膜，可以适当增加Tween-20的浓度，封闭之前，先用封闭液将膜充分洗净，然后加入封闭液，4度过夜（保证在12个小时以上），洗膜次数增加为4次，看看会不会好一些？
vera+ (2013-7-17 11:05:03)

把封闭液里tween20的浓度提高，我以前就这么做，效果很好；此外脱脂奶的浓度要在5%。
ladyhuahua (2013-7-17 11:05:32)

你的问题跟他的差不了太多。最好用BSA封闭，你看你的第一张照片就比其他的好的多，所以继续用BSA封闭，你也要加上Tween20封闭，洗膜时间长点！你的二抗稀释度是合适的！一抗再稍微稀释稀释，增大上样量。