【讨论帖】细胞蛋白电泳奇怪图形

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-4-14 16:56 作者: guagua 来源: 分析测试百科网

我刚做WB，现在先只做到电泳，然后考马斯亮蓝染色。请问大家跑全蛋白的话假如做的好的话应该是什么样子呢？我用的是10%的胶，蛋白浓度1.1mg/ml，每孔上了15微升的样，跑出来的蛋白几乎全集中在60——110KD之间，也分不出条带，只是一团，其他位置就没有多少蛋白了，这是怎么回事呢？

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guagua (2014-4-14 16:56:51)

下图为原图，10％分离胶，左边两道是marker:分别为116，66.2，45，35，25，18.4，14.4
后面六道是提取的全蛋白，2乘的上样缓，每孔共上15ul，蛋白浓度1.1mg/ml。
最后两道是蛋白样品不够了，放在四度冰箱里很久的BSA，居然跑出了条带！

65396792.snap.jpg
glass (2014-4-14 16:57:25)

蛋白样品是如何处理的？估计和你的样品有关！
guagua (2014-4-14 16:57:49)

蛋白样品是如何处理的？估计和你的样品有关！
样品是购买的碧云天的成品裂解液，主要成分为20mM Tris(pH 7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，以及sodium pyrophosphate， β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin 。50ml的培养瓶加了300微升裂解液，冰上裂解30分钟。然后-80度保存。电泳前加入上样缓冲液后100度煮5分钟。
glass (2014-4-14 16:58:09)

上样前离心了么？
guagua (2014-4-14 16:58:31)

上样前没有离，但是提蛋白的时候离过了12000g 10分钟
guagua (2014-4-14 16:58:50)

我是一个人做WB的，没怎么看过别人做，都是从书上和园子里看来的方法。跑的好的全蛋白应该是什么样子的呢？
glass (2014-4-14 16:59:11)

1.是样品裂解后，离心12000g 10分钟取上清，然后冻存的么？如果是的话，应该可以，离心已经去掉细胞碎片等了。
2.你的样品上样时是否太粘了，如果太粘就不容易跑下去。适当稀释一下，再电泳看看。
3.按你的蛋白浓度，上样量不用这么大也可以，如果是1.0mm，10孔的小胶梳子，上10微升也不少了。
guagua (2014-4-14 16:59:29)

是离心之后取上清又-20度冻存的，做的是5ml的小胶，十孔的梳子。
vcve (2014-4-14 16:59:50)

上样缓冲液中是否有SDS,样品是否清亮?
lxh031 (2014-4-14 17:00:26)

哈，这里很热闹啊，我也来凑个热闹
楼主比较一下你的图与下面的图有无相似之处，若有，那我再继续；若无，那我就无话可说了

36957394.snap.jpg
guagua (2014-4-14 17:00:49)

楼主比较一下你的图与下面的图有无相似之处，若有，那我再继续；若无，那我就无话可说了
是的，中间没有跑开的部分跟我的一模一样啊
guagua (2014-4-14 17:01:09)

上样缓冲液中是否有SDS,样品是否清亮?
缓冲液中有SDS，是清亮的
fei1226com (2014-4-14 17:05:20)

为什么不在这里公开说说？？让大家都了解一下有好处嘛
yapuyapu (2014-4-14 17:06:15)

QUOTE:
原帖由 fei1226com 于 2014-4-14 17:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
为什么不在这里公开说说？？让大家都了解一下有好处嘛
原因有2
1 本次想借用楼主的典型例子，开展有奖读图分析活动，为本版首次尝试，欢迎大家畅谈己。
2 原因可能是多种多样的，我的观点也是猜测，在楼主进一步验证结果出来之前，还不能完全肯定。楼主已经同意验证，欢迎各位积极发表个人对本问题的看法。
fsdd817 (2014-4-14 17:09:04)

电泳缓冲液的pH是多少？
xyw5 (2014-4-14 17:09:25)

电泳缓冲液的pH是多少？
电泳缓冲液是很久以前配的，当时配的时候是调到8.3，10乘的储液，临用时稀释十倍，没有再测PH，估计应该没有大问题吧，因为marker跑的还行。
gogo (2014-4-14 17:13:14)

楼上最好还是把图片贴出来吧，这样更利于大家分析原因。
电泳缓冲液贮存液不需要调pH 的，配完了用时稀释到1乘，就是8.3。
你这个贮存液调到8.3，我觉得不对，稀释后pH会变了吧。
电泳时，pH很重要，无论是配胶的tris还是电泳缓冲液。
duoduo (2014-4-14 17:14:25)

我也是用的像楼主配的电泳缓冲液,先配好调好PH值,用的时候再稀释直接用,没有再进行调整PH值,我们的胶都跑开了啊,没有出现楼主的问题,所以我觉得原因应该不是这个吧
再说了,他的marker不是还跑的还行么,呵呵
我个人认为还是对你的样品用样品处理液处理的时候没有做好吧
我也是菜鸟,期待高手予以解决!
redbutterfly (2014-4-14 17:14:45)

上样缓冲液是配的还是买的，什么条件保存，有没有完全解冻混匀，吸取的量是否足够？最终上样是1*吗？
marker能跑好，说明胶没问题，如果不考虑蛋白制备问题的话，这个很值得考虑
guagua (2014-4-14 17:15:04)

上样缓冲液是配的还是买的，什么条件保存，有没有完全解冻混匀，吸取的量是否足够？最终上样是1*吗？
marker能跑好，说明胶没问题，如果不考虑蛋白制备问题的话，这个很值得考虑
上样缓冲液是在上海生工购买的，说明上让常温保存，我放在四度的，是2乘的，即和样品是一比一的关系。