【求助】关于touchdown PCR

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• pou (2015-8-03 17:57:42)

  通常我都是先做梯度ＰＣＲ，看在某一特定温度下有无特异性目的条带出现，如果没有目的条带，我通常就考虑换引物了，如果有目的条带，但为非特异扩增，这是才会考虑Ｔｏｕｃｈ　Ｄｏｗｎ，为了提高特异性，并保证产物的量，Ｔｏｕｃｈ　ｄｏｗｎ通常参考梯度ＰＣＲ的结果，选择目的条带刚好看不出来的那个温度，一直降到扩增量较多的第一的较高的温度，然后剩下的循环就在该温度下完成，需要注意的是我通常做Ｔｏｕｃｈ　ｄｏｗｎ时，从高温降到低温设计约１０到１２循环，以保证特异性目的条带的量比较大的情况下，非特异性带才会出现，这样特异性目的条带就会抑制非特异性片段了。至于Ｔｏｕｃｈ　ｄｏｗｎ一次就可以摸索出最适条件，我认为是不妥的，只能说它有可能让你一次就拿到你的目的片段，这时如果没有梯度ＰＣＲ作参考，我通常设计高于引物Ｔｍ值３度开始降温，降到低于Ｔｍ值５度，然后完成后面的循环。所以通常我拿到引物通常都是先做梯度ＰＣＲ，在考虑Ｔｏｕｃｈ　ｄｏｗｎ。因为ｔｏｕｃｈ　ｄｏｗｎ不可避免的会引入非特异性片段，尽管量比较少。

• 了了 (2015-8-03 17:58:01)

  照你的说法，其实梯度PCR已经完全摸出了扩增目的条带的最适条件了，又何必再用touchdown？而且我也认为touchdown确实象你说的，可以让你得到目的条带，但却会有其他非特异扩增。
  我现在的问题是，用某一温度可以有一条很亮的带，可惜不是目的带。在这个基础上改变一下温度，就有一条象是目的带的东西，但之前那条非特异扩增还是主带。而用touchdown PCR根本不能形成明晰带，全是smear。

• pou (2015-8-03 17:58:23)

  呵呵，有时候梯度PCR时，如果退火温度升高，非特异性带逐渐减少，但是到了某一温度，非特异性带和目的带都消失。但较低的另一个温度却有非特异带和目的带，这是我就要做Touch down，因为默认为引物和模板特异性结合要比非特异结合能力强（较高的退火温度），这时在较高温度下首先特异性结合，在扩增到一定的量以后，当退火温度降到非特异性带可以扩增时，因为特异性扩增的量已经较大，这样就会抑制非特异扩增，从而实现目的片段的大量扩增。我用我的试验例子来说吧：
  左边的这个L-LT01，随着温度的升高，在64.3度条带消失，而在62.4度，则有目的条带和非特异性带存在。[img][/img] [img][/img]
  这时我便考虑Touch down，从64.5度-0.5度/cycle一直到59度，touch down 结果如右下图[/img]

• pou (2015-8-03 17:59:17)

  再如第一张电泳图右边的L-LT03，我的梯度PCR结果并没有我的目的条带，或者说有，但相对于其它非特异性带，即便随着退火温度的升高，其始终比非特异性带暗，我就做了touch down，但结果如下[img][/img]
  依旧是目的片段不如非特异性带亮，所以我认为，如果说，梯度PCR结果中，没有出现目点片段，或则随着退火温度的升高，依旧是目点片段的亮度不如非特异条带亮，就不用考虑touch down，要么优化体系，要么直接换引物。

• pou (2015-8-03 18:00:33)

  这是我换了L-LT03后的新引物的梯度PCR电泳结果
  可以看出来，在低温下，是有目的条带，但其相对于非特异性带来说亮度很弱，但随着温度的升高，其量就越来越大，当到了63.5度时，非特异性带已经很弱，但仍有非特异性带，而温度再高就没有条带出现，这时我??梢宰鯰ouch down，来获得较好的特异性扩增。

• pou (2015-8-03 18:00:54)

  
  所以，鉴于你所说的你的非特异性带亮度远大于特异性带，我建议你换引物，或者优化反应体系，而不用再重复的摸索PCR循环的条件了。
  如果需要的话我可以提供其它的电泳图。

• 了了 (2015-8-03 18:01:19)

  呵呵，有时候梯度PCR时，如果退火温度升高，非特异性带逐渐减少，但是到了某一温度，非特异性带和目的带都消失。但较低的另一个温度却有非特异带和目的带，这是我就要做Touch down，因为默认为引物和模板特异性结合要比非特异结合能力强（较高的退火温度），这时在较高温度下首先特异性结合，在扩增到一定的量以后，当退火温度降到非特异性带可以扩增时，因为特异性扩增的量已经较大，这样就会抑制非特异扩增，从而实现目的片段的大量扩增。我用我的试验例子来说吧：[img][/img]
  左边的这个L-LT01，随着温度的升高，在64.3度条带消失，而在62.4度，则有目的条带和非特异性带存在
  觉得你说得有道理。只是我说一开始pcr得到非特异带，后来改变条件得到特异以及非特异带，这个改变条件其实并非升温，而是降温。而且引物应该也不是问题所在，因为待扩增片断全序列已经明确知道。

• pou (2015-8-03 18:01:37)

  你的意思是在高温退火得到的是非特异性条带，但降温后得到了目的条带和非特异条带，对吗？在我的L-LT03号引物已经说了，如果高温出现的非特异性带较特异性带亮，我想低温应该较特异性带更亮。所以你做touch down我想肯定很难得到特异性好的目的条带。建议你优化体系，或者换引物。还有怎么会认为和引物没有关系呢？我再给你发照图片，这是我扩增同一段所用的三对引物，而且我待扩增的全序列也是明确的。[img][/img]
  我订购引物的顺序依次为L-LT03，xL-LT03，S-LT03。他们的扩增结果都不同，特异性相差也比较大，只有最后一条引物值得我做Touch Down。
  而且如果序列明确我觉得换引物比优化体系可能来得更快，前提是定引物方便。

• 了了 (2015-8-03 18:01:53)

  我的确实是降低退火温度才同时出现了特异带和非特异带。没有用凝胶分析软件分析过，直接看是较高退火温度及较低退火温度出现的非特异带一样亮。你的全序列已知，那引物必须是其互补序列，只是通过改变引物长度来调整而已吗？

• pou (2015-8-03 18:02:13)

  
  有的是，有的不是，但我通常就换另外一个地方来设计引物。这样保险性我想更大。我用的是Primer 5设计的引物。
  还有我劝你最好能每次保存你的实验结果，对你分析和将来写文章都是很有用的。

• 了了 (2015-8-03 18:02:34)

  
  还是不太明白你说的换个地方设计引物，能说得细点吗？还是你的意思是全序列保全了，他周边的无关序列稍稍增减一点没关系，在这个原则上换个地方设计引物？

• pou (2015-8-03 18:02:52)

  是的，只要你的目的片段在，就行了，可以扩展一下设计引物。还有就是我不知道你是在做什么样的ＰＣＲ，　不知道换引物是否可行？

• 了了 (2015-8-03 18:03:09)

  
  估计也行，可以试试。还想请教，就是设计退火温度时，考虑的是引物互补区的Tm还是整个引物的Tm？如果我设计引物是一端引物互补区大概18bp，而非互补区加了纯化标签&酶切位点、保护碱基什么的几乎和互补区一样长了，另一断引物基本互补，不增加其他序列，这样扩增起来会不会有难度？或者说这样是否可行？

• pou (2015-8-03 18:03:26)

  
  这个我就不敢说了，我没有设计过这样的引物。你引物的一端互补区有18bp，那么你前几个反应的退火温度肯定不能高，这样就可能会有非特异扩增；而你的引物总长约36bp，后面的循环你就可以提高退火温度，这样就能保证你的引物能和你前几个循环的扩增产物较特异的结合扩增。因为我没做过这样的引物，所以我只能给你点建议让你参考，你可以前几个循环的退火温度参考那18bp的Tm值，后面的循环参考整条引物的Tm值。当然也可以考虑做toch down，但是不是降温，而是升温。每个循环升高一定温度，从低于18bp的Tm值3-5度，逐渐升高到低于36bp的Tm值3-5度。说实话，我没做过这样的实验，只是理论上推理一下，希望对你有帮助。
  还有就是上面的电泳图是我得实验结果，不能放得太久，就自己删了，请见谅。

• 了了 (2015-8-03 18:05:45)

  
  我也是这么想并设计PCR程序，结果上面已经说过。然后我就突然听说了一个叫touchup PCR的新名词，似乎在这里也没看到相关的介绍。你对这个有什么看法？
  你先前把自己的实验结果拿出来就很大度了，真的，谢谢。

• pou (2015-8-03 18:06:41)

  
  相关疾病：
  盲
  PCR其实也是一个很灵活的技术，要不然ＰＣＲ发现这短短几十年里各种PCR技术层出不穷，最终目的都是为了获得自己的目的片段来调整反应体系和反应循环，但这种调整也不是盲目的，而是依据PCR的基本原理来进行调整，无论是touch down还是touch up，只要能拿到自己的目的片段就行了。

• okhaha (2015-8-03 18:07:00)

  
  总结一下：
  PCR扩增可能出现三种情况：
  一，特异性很好，这是我们所期待的；
  二，绞尽脑汁优化条件也无任何条带出现，这是我们最不想看到的，但很少出现；
  三，既有特异性带，又有非特异性带，这是经常出现的。这种情况又有3种可能及其拟解决方案如下，即随着退火温度的增加（采用梯度PCR），理论上是条带都减弱，如果用数字来表示，特异性带量÷非特异性带量之和＝
  1.无限趋于0，更换引物；
  2. 1，更换引物或优化体系；
  3.趋于无穷大，达到目的。

• pou (2015-8-03 18:08:41)

  
  呵呵，谢谢，楼上的精彩总结，我想说一点就是只要特异性带比任何一条非特异带都亮的话，就可以优化体系或循环，并非一定要换引物。不知你是否看到了我的电泳图，如果需要的话我可以再贴上去，呵呵。

• xyw5 (2015-8-03 18:09:00)

  
  我重新设计引物了，正在合成中，还不知道结果如何，希望顺利吧。谢谢大家的支持。

• tianmei001 (2015-8-03 18:09:34)

  
  看过之后感觉受益菲浅！我现在也正做PCR，碰到了这种同时有非特异性条带和特异性条带的情况，且非特异性条带更亮一些，一直不知该怎么样去调整，现决定按z_lu_er战友的经验好好分析一下，希望也能解决我的问题，谢谢啦！