Nature解答Cas9基因组编辑核心谜题

2014-2-10 13:03 来源: 生物通
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  有一种蛋白在细菌免疫系统中起着至关重要的作用,并正快速成为一种很有用的遗传工程工具。现在有关这一蛋白的一个中心问题已经获得了解答。来自劳伦斯伯克利国家实验室和加州大学伯克利分校的研究人员,确定了这一叫做Cas9的细菌酶在病毒感染过程中是如何在RNA序列的引导下识别和降解外源DNA,以及在动物和植物细胞中诱导位点特异性遗传改变的。通过结合单分子成像和大量的生化试验,该研究小组证实Cas9的基因组编辑能力是通过称作为“PAM”( protospacer adjacent motif)的短DNA序列来实现的。

  该研究的领导者、生物化学家Jennifer Doudna 说:“我们的研究结果揭示了PAM的两个主要功能,解释了它对于Cas9能够靶向和切割与导向RNA相匹配的DNA序列如此至关重要的原因。在外源DNA的靶向位点附近存在PAM,而宿主基因组的这些靶向位点则缺乏PAM,使得Cas9能够精确区分必须降解的非自身DNA和几乎完全相同的自身DNA。此外,存在PAM也是激活Cas9酶的必要条件。”

  随着基因工程微生物,例如细菌和真菌,在绿色化学生产有价值的化学产品,包括治疗药物、高级生物燃料和生物降解塑料中发挥越来越大的作用,Cas9正在成为合成生物学从业者一种重要的基因组编辑工具。

  Doudna说:“了解Cas9如何能在数百万到数十亿碱基对长的基因组中找出特异的20个碱基对的靶序列,或许能够改进在细菌和其他细胞类型中的基因靶向和基因组编辑工作。”

  细菌微生物面临着来自病毒和称作为质粒的侵入核酸片段无休止的攻击。为了生存,微生物利用了一种基于核酸、以CRISPR遗传原件为中心的适应性免疫系统。通过结合CRISPRs和RNA导向的内切核酸酶,例如Cas9,细菌能够利用专门的小crRNA分子,引导靶向及降解侵入病毒和质粒中的匹配 DNA序列阻止它们复制。CRISPR–Cas免疫系统有三种不同的类型。Doudna和她的研究小组将焦点放在了II型系统上,其独特地依赖于RNA编程Cas9在靶位点上切割双链DNA。

  论文的主要作者、Doudna 研究组成员Samuel Sternberg 说:“Cas9和RNA导向的相似复合物是如何在整个基因组中找出并识别匹配的DNA靶点,一直以来是CRISPR–Cas领域的一个大谜题,这是一个经典的大海捞针的问题。所有正在开发RNA可编程Cas9实现基因组操作的科学家们,都依赖于它能够在细胞内靶向独特的20个碱基对序列的能力。然而,如果 Cas9只是在整个基因组的一些随机位点盲目地结合DNA直至撞到它的靶DNA,那这个过程将会非常费时,它有可能无法有效地实现细菌免疫,或成为一种基因组操作工具。我们的研究表明,Cas9是通过首先寻找PAM序列来确定它的搜索范围。这加速了定位靶DNA的速度,最大限度地缩小了解读非靶向DNA位点的时间。”

  Doudna、Sternberg和同事们利用一种独特的DNA窗帘分析法和全内反射荧光显微术(Total internal reflection fluorescence microscopy TIRFM),在Cas9结合与解读DNA之时对单个Cas9进行了实时成像。DNA窗帘技术提供了前所未有的、关于Cas9靶点搜寻过程机制的一些新认识。采用传统的大量生物化学检测验证了成像的结果。

  Sternberg 说:“我们发现Cas9只在识别PAM后才利用RNA–DNA碱基配对来解读DNA寻找匹配的序列,这样避免了意外地靶向细菌自身基因组中的匹配位点。然而,即使Cas9以某种方式与自身基因组中的一段匹配序列错误地结合,没有PAM也无法触发催化核酸酶的活性。利用这种DNA解读机制,PAM提供了两个冗余的检查点,确保Cas9不会错误地破坏它自身的基因组DNA。”