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【求助】SDS-PAGE问题
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最近一段时间电泳一直跑不好，跑胶时有一部分样品在上样孔中跑不下去，出来的带很难看，比正常的宽，模糊。不知道该怎么形容。看图片吧。我一般都是加上样buffer后煮沸5min，时间应该够，而且他们有煮10min的，也是跑的这样。loading buffer也换过了，还是不行。不过应该是样品处理的问题。因为我超声波破碎后再跑就正常。有碰到过这种问题的吗？原因是什么？谢谢。
中间的那条带就是直接煮的样。
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最新回复
喵咪 (2014-3-23 22:38:37)
wiwi (2014-3-23 22:40:41)
1。是否是电泳缓冲液陈旧，更换电泳缓冲液看看；
2。样品蛋白浓度太高（或菌量太多），加入loading buffer后蛋白有凝块，或加入loading buffer速度太快，也会出现凝块，这样电泳时有拖尾；
3。你上样时估计样品溢出了上样孔，因为marker条带中也混有样品条带。
阿司匹林 (2014-3-23 22:40:58)
看看会不会是这个原因
样品的盐浓度太高会引起样品条带挤压旁边的marker条带
wiwi (2014-3-23 22:41:16)
birdfish (2014-3-23 22:42:47)
蛋白的上样量大的缘故
dior (2014-3-23 22:43:05)
我看有的帖子说
如果有核酸的话
就会出现象你图片上的竖带
而且超声处理后带型变好
就是因为把核酸处理掉了吧
wiwi (2014-3-23 22:43:38)
misswu61 (2014-3-23 22:44:54)
我遇到过
我把样品有煮了5分钟
离心后
轻轻取上清上样就好了
kuaizige (2014-3-23 22:45:15)
可能是标本的上样量过大或蛋白量过大的缘故
小螺号 (2014-3-23 22:45:35)
求助一个问题：未知蛋白的检测
已知Hela细胞在某种条件刺激下（如某种化学物质）会释放一种或几种未知的蛋白，现在我想检测一下这一种（或几种）蛋白质的成分。
初步设想是：收集有刺激和无刺激条件下的培养基分别做SDS-PAGE找出不同的条带然后做质谱分析。
目前遇到的困难是：
1血清成分复杂
2细胞受刺激分泌的未知蛋白含量可能很少
侯高手愿意赐教！
wu11998866 (2014-3-23 22:45:55)
问题原因：样品太浓了，煮的时间太短了。
菌体用水稀释一倍，再加样品处理液，煮的时间加长到10min。
样品明显漂进marker上样孔了。是不是上样体积太大了。
hustwb (2014-3-23 22:46:19)
二，样品里面本身有不熔性的沉淀。
总之，是沉淀造成的。
下面你该知道怎么办了吧！！！
fqswdzd (2014-3-23 22:47:31)
量多了一点。可减少样品量。或更换缓冲液。
@STAR@ (2014-3-23 22:47:50)
煮过离心取上清电泳啊！
ritou1985 (2014-3-23 22:48:18)
1.离心不充分、煮的时间不对、蛋白量太多而Sample buffer太少等产生沉淀造成的
2.可能是配胶Buffer或电极buffer有问题，pH值是否正确。
ALALA (2014-3-23 22:48:41)
这种现象在《蛋白质电泳试验技术》（郭尧君 编著）中称之为“纹理”现象（streaking）,书中分析，这“常常是由于样品中的不溶颗粒引起的。克服的办法是增加溶解度和离心出去不溶性颗粒”
不过我认为书中漏了一点，就是如果蛋白样品液中本身含有较高浓度的钾离子的话，在蛋白溶解的过程中会有一部分钾离子和loading buffer中的SDS反应，产生沉淀，这部分沉淀能不能通过离心去处掉姑且不论，即使能够去除掉，可能样品液中还有残留的另一部分钾离子，它们在上样后会和胶中的SDS反应，同样会产生沉淀。
但愿你的样品中不含钾离子（例如在蛋白纯化的过程中可能使用了含钾离子的磷酸缓冲液或在层析洗脱的时候用了氯化钾等等）。
当然如果在配胶的时候所用的试剂中有大量沉淀的话也有可能会造成这种现象。
从图上来看，上样量确实有点偏大，但并不是过大。也不至于会造成“纹理”。
最后，建议你： 1.仔细检查配胶的试剂有明显的沉淀否，最好重新配。 2. 检查一下蛋白纯化的过程中是否引入了钾离子，若有，可先透析或过一次凝胶过滤柱。 3.加大离心速度和时间，以彻底出去不溶性颗粒。
最最后： 实验过程中难免遇到各种无法预料和奇怪无比的现象，不要灰心
ALALA (2014-3-23 22:49:14)
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