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【讨论帖】心肌细胞培养互助
【讨论帖】心肌细胞培养互助
心肌细胞的分离和培养比较复杂，成年动物心肌细胞就更难做。我原来想做成年大鼠心肌细胞培养，并专门去北京一所著名大学学习，令人失望的是他们也做不好，只做乳鼠心肌细胞培养。
但我知道分析测试百科网里卧虎藏龙，没有什么能难倒你们。今天我牵头辟出一块空间，是为了让大家有一个互通有无、互相帮助、取长补短、共同发展的平台，使得心肌细胞能够越长越好、越跳越欢。
热烈欢迎各位高手的加盟和批评、指导！
请斑竹和同道支持！谢谢！！！
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最新回复
xevin (2015-5-11 18:08:45)
喇叭花 (2015-5-11 18:09:04)
QUOTE:
是不是你的胰酶放得太少，一般十几只乳鼠的心肌，一次用的胰酶是10ml左右的，浓度0.06%，不会吸不出来的啊。那种蛋清的状态是组织块没有消化完全的，和一些细胞消化出来胶质、核酸，等等混杂在一起。
只要静置片刻，就可以单独把胰酶溶液(含细胞的细胞悬液)吸出来就好了。
cwcwcww (2015-5-11 18:09:19)
胶原酶对胶原的消化作用强，它仅对细胞间质有消化作用而对细胞没有影响，可使上皮细胞和胶原成分分离而不受损害，相反，胰酶作用时间长会对对细胞产生破坏作用。因此我觉得你的细胞状态不好可能不是胶原酶的原因。我也在养心肌细胞，消过程中也会有你说的蛋清一样的状态，但没有是整个上清都是的情况，可能正如青山兄所说是你的胰酶放得太少了，5只老鼠可以放3ml的胰酶，我听师兄说这种蛋清样的东东含的细胞最多，所以要剂量把它吸出来，另外我认为吸的时候切勿把组织块吸上来，我试过吸的组织块过多，离心后组织快都还飘在悬液中，一倒就把牵有细胞的组织块一块到走了，到最后所得的细胞就少很多。我也在摸索之中，所说的仅供参考。祝成功！
ending (2015-5-11 18:09:33)
同意楼上的观点。我用过II型胶原酶和胰酶＋EDTA，都是Gbico的。我发现还是用胶原酶消化的好，细胞得率高，而且活力也好。用胰酶，每次都会对着一砣粘冻样的东西发愁（我想应该是楼主所说的蛋清样物质）。最后发现只有加大胰酶的量。我觉得一方面是怕胰酶的量不足以消化，一方面也觉得增加了整个消化体系，使得粘冻样物质体系相对减少，更易于消化后上清的吸取。
不知道greenmood
怎么吸取那些东西。我发现我更本无法 把这写粘冻样的东西吸出来！郁闷！
feiya (2015-5-11 18:09:48)
ukonptp (2015-5-11 18:10:10)
milkdog (2015-5-11 18:10:26)
FBS?看来楼上弄错了，应该是小牛血清来养的，用FBS只会促进成纤维细胞增殖。
ero11 (2015-5-11 18:10:41)
大鼠心肌细胞比乳鼠心肌难养，用无血清培养基，呈杆状，横纹清楚，在培养基里细胞不搏动。
大鼠心肌细胞分离一般是采用二型胶原酶分离，浓度为1mg/ml（用无钙台氏液配制），同时酶液里加入牛磺酸，BSA。一般采用Langendorff灌流的方法，大鼠开胸后，迅速取出心脏，放入冰的台氏液中，找到主动脉后，挂上Langendorff装置，衡流泵灌入无钙台氏液（37度），开始心脏会搏动几下，这样把心脏中的淤血挤出（此处也有人用有钙台氏液灌流，好让心脏充分搏动，把淤血挤出，不过我们摸索发现只要取心脏到挂上去的时间短，一般搏动几下就能把淤血清楚干净了）。几分钟后，换酶液开始灌流心脏，一般开始时，心脏较软，待消化一段时间后变硬，继续消化后又变软，且心脏发白，这时候就可以停止消化，将心室剪下，放入KB液中，用剪刀剪碎后，用滴管吹打，取上清，继续加入KB液，吹打，直到上清液不浑浊为止，一般吹打3－4次即可。将各次上清合并，吹打过滤后，沉降20分钟左右，弃上清，加入无血清培养基（MEM，不含L－谷氨酰胺，并加入肌酸，牛磺酸，BSA，肉毒碱，HEPES），吹打，1000转/分离心半分钟，弃上清，再洗1－2次后，将沉淀加入到6％的BSA中沉降15－20分钟（纯化心肌细胞），然后计数，点板或培养。
此法中如果各步注意无菌操作，最后先用加倍双抗的培养基培养24h后，再换正常培养基，可适用于条件不是很好的试验室。如果能在板或瓶内加入Laminin处理后，贴壁很好。如果分离出来的心肌细胞，逐级复钙后培养，状态更好。最佳状态此中方法能培养7天以上。
xyw5 (2015-5-11 18:10:55)
我做的乳鼠心肌细胞原代培养是用的0.25％的胰酶，24小时后倒是能看到搏动，但是只是零星分散的搏动，不是成片的同步搏动，像是在抽搐！郁闷！
另外上面粘的血细胞太多，用PBS冲都冲不掉。我的细胞是准备用来放在激光共聚焦显微镜下观测一些指标的，但血细胞太多怕会影响实验数据。如何去除？请各位高手指点一二！多谢！
ero11 (2015-5-11 18:11:12)
另外是不是胰酶浓度太高了，最好用0.1％左右的好一些，就是要消化次数多一些，这样对细胞损伤小，可能细胞状态能好一些。最好取3－4天的乳鼠，这时候的乳鼠心肌细胞状态较好。
做Confocal的话，需要养在24孔板或者6孔板中，并在点板前在孔内放上玻璃片，让细胞长在玻璃片上，这样才便于试验时的观察。
woshi (2015-5-11 18:11:27)
多谢上面的这位兄弟！可是剪下来的心肌那么小，用镊子逮都逮不住，用什么怎么挤啊？另外用0.1%D 胰媒，每次消化多少分钟合适呢？
ero11 (2015-5-11 18:11:42)
先挤一会再剪，剪心室，大概就是心脏的下半部分。放入另一干净的PBS溶液中，再洗洗。0.1％的胰酶每次消化大概10分钟左右，吹打后，静置1分钟左右，然后吸取上清，加入胰酶继续消化。
join (2015-5-11 18:12:32)
请问各位大虾，你们培养乳鼠心肌细胞用哪种血清？我目前用国产四季清胎牛血清，总觉得细胞生长状态不理想，搏动不一致且持续时间短，有时2，3天就不跳了（我没加BRDU），细胞内出现点状物质，像是快凋亡的细胞，是不是营养不够？
gmt (2015-5-11 18:12:46)
各位同胞，你们做心肌细胞培养用的剪子和镊子是普通的吗，还是纤维剪子和 镊子？取出的心脏的包膜是如何取下来的？
yhz1973 (2015-5-11 18:13:30)
我做的乳鼠心肌细胞原代培养是先备用三个培养皿，里面加入HANKS液，取出心脏后放入培养皿中依次清洗三次，清洗时注意剪掉非心肌组织，及血渍后，将心肌组织剪碎约1MM大小，后用0.125%胰酶消化,每次约8分钟,前2次舍弃上清,直至将心肌全部消化为止.我的经验一个乳鼠约1ML培养液.
zhy平平 (2015-5-11 18:14:35)
october7 (2015-5-11 18:14:52)
bluelake (2015-5-11 18:15:07)
QUOTE:
可以点击My Forum,在My Forum中找。也可以加入My favorites,找起来更方便。详见新手成长板块相关内容。嗅嗅 (2015-5-11 18:15:22)
尊敬的各位老师，请问心肌细胞培养有没有可能获得人的心肌细胞来培养，比如心胸外科手术，或者介入，或者购买；如果不能，那是用成年大鼠的还是新生乳鼠的心肌细胞对实验说服力强；培养基用DMEM，它的高糖和低糖的有什么区别；是否不含培养基谷氨酰胺的更好，因这样可以减少纤维细胞的增值，使培养的心肌细胞更纯；还有培养瓶用25平方厘米的还是75平方厘米的好些，用75平方厘米的是不是太大了，心肌细胞不容易接触生长波动；还有心肌细胞培养所用的缓冲液有哪些，配平PH值时用的标准液在哪里可以买到，具体怎样自己配制缓冲液，如Hank's液，PBS液等？啊，一起问了这么多困扰我的问题，急盻各位老师指点迷津，虽然我也在丁香园里下载了一些关于细胞培养的资料看，但对以上问题还是拿不准，特此请教您们，衷心的感谢！
mickeylin (2015-5-11 18:15:36)
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