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专家指南：如何开展基因表达研究（二）
Q2：您采取哪些质量控制步骤?
Gary Hardiman(加州大学圣地亚哥分校)
对于涉及RNA的应用，利用安捷伦的生物分析仪或类似产品对RNA样品进行质量控制是必需的，可确保RNA是完整的，没有降解。对于芯片，cRNA 的生物分析仪分析也很有用，可确保杂交之前均一的转录本扩增。芯片上对照探针的行为可警告数据的潜在问题。对于RNA测序，RNA通常片段化，并逆转录成 cDNA，加上接头。利用安捷伦的生物分析仪或2200 TapeStation对RNA-seq文库进行QC很重要，可确保插入片段存在，且文库中没有引物二聚体。在测序之前，应该通过qPCR对DNA进行准确定量，这能够指导DNA的上样量。对于qPCR表达研究，必须使用适当的看家基因来校正不同样品的起始量，它还能作为RNA完整度的指标。
Chris Harrington(俄勒冈健康与科学大学)
中心实验室收到的所有RNA样品都会利用我们的RNA评估服务来评估。这包括数量、纯度和质量(完整性)的测定。预计浓度高于20 ng/μl的样品会使用紫外分光光度计定量。更稀的样品会在测定之前浓缩，如果数量有限，则利用RiboGreen荧光分析定量。在定量之后，利用安捷伦的生物分析仪或Caliper的LabChip GX检查RNA样品的大小分布。随后评估浓度测定的结果、UV260/280和UV260/230的比值以及电泳图，来确定每个样品的整体质量。我们认为在表达分析中最好使用质量差不多的样品，以免带来质量偏差。
在选择RNA进行图谱分析之后，每个样品还需要额外的QC步骤，这取决于所使用的技术平台。一般而言，cDNA文库(RNA-seq)以及cRNA或cDNA目标(芯片)都经过紫外分光光度计定量，并在生物分析仪上分析。测序文库在模板制备之前还要通过PCR定量。
Craig Praul(宾夕法尼亚州立大学)
在基因表达研究中，良好的RNA质量对产生准确一致的结果很关键。许多实验室尚未意识到分离高质量RNA的重要性，以及从某些组织中分离好的RNA有多难。
我们采用NanoDrop和安捷伦的生物分析仪，偶尔使用Qubit进行RNA质量控制。研究人员须清楚了解这些仪器的能力，才能正确使用。 NanoDrop通过测定260/280和260/230比值来评估RNA的纯度。不过NanoDrop不能评估RNA的质量，也不能了解污染DNA的存在，因为DNA的光谱性质与RNA非常相似。
安捷伦的生物分析仪可用于评估RNA质量。此仪器产生RIN值(RNA完整性指数)，是RNA质量的客观测定。RNA值在1-10之间变化，其中 10代表最高质量。我们不使用硬指标，因为从某些组织中很难获得高质量的RNA。不过，我们通常不使用RIN低于6-7的样品(困难组织)，预计组织培养物的RIN值在9-10。与RIN值同样重要的也许是一组样品的RIN值范围。我们希望看到的范围是1到1.5。对于组中的异常值样品，我们通常建议重新分离。例如，如果一组中的大部分样品的RIN值都在9-10，但有几个在7-8，我们会担心那些。我们正试图避免差异降解被误认为是差异表达。
大部分RNA分离方法都产生高纯度的RNA，污染DNA很少，但有时候DNA也会是问题。为了准确评估RNA浓度和污染DNA的浓度，我们使用Qubit。这种仪器采用荧光染料特异结合来实现混合物中RNA和DNA的准确定量。
Ralph Schlapbach(瑞士联邦理工学院)
无论选择了何种技术，芯片或测序，所有样品都在生物分析仪上分析，以检查完整性，并确定RNA或DNA是否降解。通过荧光定量(Qubit)再次确定样品浓度。由于某些应用需要特定的片段长度，我们会在生物分析仪、Caliper GX或安捷伦的Tape Station上检查大小分布和浓度。如果所有QC步骤都顺利通过，我们就可以放心地保证定义的分析产量，对于HiSeq测序，每个通道是25-30 Gb Q30数据。在数据方面，新一代测序的读取首先经过碱基质量和序列内容的质量控制。对于de novo转录组测序项目，首先预处理原始读取，去除低质量的数据和污染物。我们进一步控制芯片杂交数据以及新一代测序数据，发现RNA降解的潜在迹象。
Q3：您采用哪些方法来标准化数据?
Chris Harrington(俄勒冈健康与科学大学)
在中心实验室，我们一般不开展数据标准化，只是作为芯片数据标准处理的一部分。对于芯片，我们使用芯片供应商提供的默认标准化算法。对于qPCR，我们利用单个参考基因或一组参考基因来标准化数据。
Ralph Schlapbach(瑞士联邦理工学院)
标准化方法的选择在于表达水平的假设和数据中可能存在的偏向。标准的假设是研究中绝大部分基因的表达水平不变，上调和下调是对称的。鉴于这一假设，对数表达值的中值或平均值都是很好的选择。如果数据表现出信号依赖的偏向，那么信号依赖的标准化是必要的。许多行之有效的处理方法都有内置的标准化，例如，Affymetrix的RMA总结方法包括分位数标准化(quantile normalization)。一般来说，我们以同样的方式处理表达估计值，而不管它们是通过测序还是芯片产生的。
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