查看完整版本请点击这里：
【求助】请WB达人进来帮助分析一下原因吧，有图
【求助】请WB达人进来帮助分析一下原因吧，有图
我是新手。做了2个礼拜了吧，原来一直没有结果，我仔细分析了一下，找不出原因。上园子里广泛搜索，学到了不少东西。猜测可能是转膜时间太短，所以我今天新换了转膜液，延长了时间，今天总算有了吧。不过，对这个结果我很疑惑。图中m代表marker，s代表样品。marker最大位置在118处，下面是65。目的蛋白的分子量是92，santa的产品说明书上写的。从图中可以看到最亮的条带在118以上！！！如果说这条不是我所要的蛋白的话，那么这抗体也太差劲了吧，，，都抗到别的地方去了。如果是我要的，那这位置。。。。
我的参数是：5%浓缩胶，10%分离胶，总共恒压130v,2小时左右。转膜400mA，150分钟。常温5%牛奶封闭过夜，一抗（santa 羊抗鼠多抗）3小时，2抗（HRP标记）3小时。PVDF膜。试剂都是新的。
请大家帮助分析一下吧，谢谢啦。除位置问题帮助分析一下以外，还有什么做的不好的地方，也请一并指正！
国庆节都没法过咯。。。。-_-
查看完整版本请点击这里：
【求助】请WB达人进来帮助分析一下原因吧，有图
【求助】请WB达人进来帮助分析一下原因吧，有图
66327140.jpg
最新回复
zhezhe (2014-4-05 17:39:03)
先搞清楚你的蛋白信息，看看有没有别的isoform,不同isoform的蛋白大小不一样，位置肯定也不一样。然后重复一下你的实验，看是否在同一位置出现带，如果可能，可以设阳性对照。
finger (2014-4-05 17:39:22)
先确定你的蛋白大小，才可把握转膜时间等。。。
vtongli (2014-4-05 17:39:49)
楼上说得没错,
另外, 会不会是多抗非特异性呢?
二抗是羊抗的吧?
抗体稀释浓度和转膜时间是关键,
但貌似你的问题不是出在这.
阳性对照最好做一做了.
惊醒ing (2014-4-05 17:40:11)
可惜没有标准品
xueyouzhang (2014-4-05 17:40:30)
400mA 150min的转膜时间够长的
92kD的蛋白没有必要这么久
300mA 90min足够了
二抗没有必要那么长时间 1h就够 顶多2h
Marker怎么会显影？
惊醒ing (2014-4-05 17:40:59)
我也不明白marker怎么会显影。。。。@_@!
问了几个人说，偶尔是这样的，所以也没在意
昨天问了个牛人，他对这结果也没法解释。首先，电泳没问题，条带跑得很开。转膜也看不出问题，不管时间电压，转上去就行。最后，那三个显然是条带，绝非污染。难道问题在抗体上？？
前几次我用的是350mA，90min，总是不出结果，所以把条件调整了，而且把膜剪大了点，于是。。。。
gemei0115 (2014-4-05 17:41:26)
个人认为这个结果不太可信.
1. 预染marker显影,这说明你的抗体孵育有问题.如果是室温的话,一抗和二抗时间都太长了.
2. 如果那条亮带是你的目的条带,我认为这个条带至少也在200kD左右了,根据我的经验一般来说分子量越大蛋白条带应该越细(除非表达量特别大的).而你的条带很粗很亮,看起来比较像没有跑开的蛋白条带,因此建议你将染胶图像和染膜的图像都发上来供参考.
建议:
1.重新跑两块胶,一块染胶,一块转膜,确定胶跑得没有问题,新配的试剂并不一定没有问题的,PH不对的,跑不下来的很多的.这一步相当重要,,不然后面一切都是白搭.
2.查询目的蛋白相关信息,不要放弃,说不定这是一个重大的科学发现呢!
希望lz反馈实验结果,以便进一步讨论,祝国庆快乐,实验顺利!
youreyes (2014-4-05 17:42:30)
marker分子量我不知道有没有问题
显影是正常的：有的公司专门开发了这样的产品，我用过的。
惊醒ing (2014-4-05 17:42:53)
QUOTE:
高人！就按你说的做！明天恐怕要配一天的试剂了，有结果我一定贴上来！yyaxw84 (2014-4-05 17:43:11)
130v跑电泳,是不是有点大了,我们都是80v跑浓缩胶，100v跑分离胶.
misswu61 (2014-4-05 17:44:03)
是不是蛋白煮的时间或温度不够，煮过的蛋白再跑最好65度5min
2541 (2014-4-05 17:44:36)
二抗时间过长了，缩减至30min
大海啊故乡 (2014-4-05 17:45:02)
130v跑电泳电压不高，如果pH值偏低，恐怕还要加大电压才能跑的快些。
楼主好象没有说是预染marker，所以可能显影，前面我说过。
有个最简单的办法：
转膜后用丽春红染膜。可以看到转膜的情况，然后洗去颜色，可以继续WB一张膜就够了
Ao7 (2014-4-05 17:45:20)
个人建议：首先：SANTA的抗体很差劲，其特点就是广而不精，就是什么抗体都有，什么抗体都不好用！你最好换个其他厂家的抗体试试，Abcam、BD的都不错。其次：我以前用也遇到过这类情况，胶顶部总有很亮的非特异性带，有人说可能是蛋白二聚体，你可以查下你的目的蛋白是否有二聚体的形式存在，你可以在煮过蛋白后立即将样品放在冰上冷却，阻止蛋白聚合，我试过，但对我的目的蛋白效果不大，最后还是换了抗体才好。
lucky!
huifeng0516 (2014-4-05 17:45:43)
10%的分离胶，92kD的蛋白按理应该就是在分离胶的上端啊。个人认为目的蛋白的位置没错，只是楼主把marker的大小弄错了而已
惊醒ing (2014-4-05 17:46:47)
这两天我又在另一个技术比较好的实验室请牛人做了一下，还是没有结果。在90kd处没有条带，反而在40处有两条。现在初步可以判定：要么是我样品制备有问题要么是一抗有问题。至于图中出现的 三条带，应该不是我要的，我也不知道是什么，后来做也没有出现过了。
关于样品制备我觉得没什么难的啊！我的步骤如下：从-80度冰箱取出肺组织，常温解冻，称量，按照公司购买的蛋白裂解液说明书要求，100mg组织加1ml液体，后进行匀浆操作。后12000转离心30min，取上清保存并测量浓度，还蛮高的。再后来就是按照4：1的比例加入loading buffer，将水烧开，丢进去5分钟，取出迅速置于冰上。
我就是这么制备样品的，各位看看有问题吗？？难道是解冻那一步？我觉得这样没什么吧，其它的我就找不出原因了。
惊醒ing (2014-4-05 17:47:24)
惊醒ing (2014-4-05 17:48:06)
惊醒ing (2014-4-05 17:48:28)
楼主好象没有说是预染marker，所以可能显影，前面我说过。
有个最简单的办法：
转膜后用丽春红染膜。可以看到转膜的情况，然后洗去颜色，可以继续WB一张膜就够了
......
=============================================================================================================
我没有说清楚，不好意思，是预染的marker。转膜以后可以非常清楚的看到marker，并且正反面我都不用标记了，因为正面的marker颜色深，而膜反面的颜色浅。我也用丽春红染膜，也能看到条带，转膜是应该没问题。
惊醒ing (2014-4-05 17:48:47)
QUOTE:
对了！我这里也有人说是蛋白二聚体！从位置上看差不多正好是2倍的样子。但是后来也觉得有点勉强：因为蛋白是煮过的，并且我保证操作没问题。还有啊，我跑的就是变性胶，应该不会“聚体”了吧。
你说对你的蛋白效果不大，你是什么蛋白阿？我是ACE2。看来你还是我的“前车”呢。ACE2有二聚体吗？
【求助】请WB达人进来帮助分析一下原因吧，有图