【求助】相当的郁闷，pet28a/BL21(DE3)系统不表达

最新回复

• eric930 (2014-5-31 15:26:08)

  
  首先，做大肠杆菌原核表达时，须要注意一点的就是所表达的外源蛋白对宿主本身没有毒性，否则会被宿主产生相应的蛋白酶降解。此外，在诱导表达之前，要确保你构建的表达框架是否正确，这一点很重要，直接关系到你所做的一切。另外，如果有毒性，看是否由于稀有密码子的原因，导致表达量过低，无法检测到或是由于形成包涵体，没有正确的检测方法而认为实验失败。上述因素请加以考虑，祝你实验顺利！

• zsxan1990 (2014-5-31 15:26:38)

  
  相关疾病：
  头痛
  我也是这样。正在为这事头疼。
  我跑了几次胶，都没有明显的表达。
  而且找不出什么原因。

• u76mp (2014-5-31 15:27:09)

  
  我的情况与楼主 一样.只是 我以前做过几个测序错误的质粒,表达的多不错,可是一旦连上正确的序列却不表达.为这个事我愁 啊!这 是否真的意味 着楼上所说的所表达的外源蛋白对宿主本身没有毒性???
  请高手指点.

• 尘朵朵 (2014-5-31 15:27:30)

  
  我是同时做了六个片段的表达，有些是正向引物一样，反向引物不一样，有些是反向引物一样，正向引物不一样，检查了可能的双酶切位点搞反以及移码的情况，表达框应该没有问题，现在最担心的就是gxumxc所说的稀有密码子的原因，以前做原核表达用的是pet32a/Rosetta-gami(DE3),一直都没有考虑稀有密码子的问题，实验室也没有人做过pet28a/BL21(DE3)的表达，万一真的是稀有密码子的问题，我该怎么做？还有挽救的余地吗？

• 尘朵朵 (2014-5-31 15:29:36)

  
  刚刚查了些资料，发现要表达的序列有比较多的连续的稀有密码子，而表达宿主菌BL21(DE3)没有Rosetta-gami(DE3)那样可以提供稀有密码子tRNAs,所以现在初步怀疑是由于这个原因造成的不表达，觉得现在我好像有两个选择，一是更换载体和宿主菌，用比较稳定的pet32a/Rosetta-gami(DE3)来重新表达；二是不换载体，换一种可以表达稀有密码子的宿主菌如Rosetta-gami(DE3)，但是pet28a是kan抗性，Rosetta-gami(DE3)含有tet,kan,cam抗性，没有抗性标记，可不可以在pet28a载体上加一个amp的抗性，或者消除掉Rosetta-gami(DE3)的kan抗性标记？有没有人做过相关的这样的工作，能不能给点建议？等待结果中。。。

• 079777chao (2014-5-31 15:30:07)

  
  楼上是为了让表达的蛋白可溶性更好，不一定能解决你的问题。ROSSETTA你可以试一下。我碰到过类似的情况。没有作用。毕竟影响表达的因素太多了。有许多情况不是转录的问题，而是翻译和翻译后的问题，和氨基酸序列也有关系。
  强烈建议你仔细研究一下培养条件和诱导条件，有时候条件不同有着天壤之别。
  或做融合表达，比如用pET32a，与TrxA蛋白融合，或者GST融合，一般单独难表达的融和后都能有一定程度的表达。

• am10 (2014-5-31 15:31:01)

  
  我也有同样的问题，同时作了2个克隆，载体是pET30a，一个表达，一个不表达。
  同意楼上的建议，因为我还表达了另外几个蛋白，载体是pMalc－2x，37度不表达，在30度就表达了。其他因素还有IPTG，我用1mM.

• 尘朵朵 (2014-5-31 15:31:35)

  楼上你好，我已经做了培养条件的优化摸索，做了28度和37度的比较，同时IPTG的浓度也做了从0.05，0.5，1，5mm的比较，还是没有表达，不过我在加入IPTG时没有更换新鲜培养基，不知道这有没有影响。我现在猜测如你所说的那样，是因为单独难表达的缘故，所以现在正在更换载体和表达宿主菌，用pet32a/Rosetta-gammi(DE3)与TrxA蛋白融合表达。希望这一次能够出来，再不出来的话真要跳楼了。

• am10 (2014-5-31 15:31:55)

  
  有文章说，可能是质粒丢掉了，使用200ug/ml的AMP养菌。

• yjf1026 (2014-5-31 15:32:12)

  
  冒昧说一句，pET28a是真核表达载体，不适合在原核里表达

• #甜# (2014-5-31 15:32:31)

  
  请教一个问题,如何检查表达的序列中是否含有稀有密码子?Rosetta-gami(DE3)和BL21(DE3)有些什么区别呢?

• woshituzhu (2014-5-31 15:33:01)

  我也是用的pet28a/BL21(DE3)，诱导了好几次，几个片断都不表达！不知把片断切下来，换成KG载体行不行？请高手

• nut6694 (2014-5-31 15:33:33)

  优化培养条件应该有很多工作可以做，表达条件不同产量相差极大。
  你诱导之前菌浓度合适么？有时候培养稍微过头了点再诱导就不表达了。
  你也可以用乳糖来诱导；培养基中加葡萄糖等。
  如果愿意花点钱的话，试试Novagen的自诱导培养基。
  当然，换载体融合表达可能就表达了Smile
  预祝表达成功Smile

• 尘朵朵 (2014-5-31 15:33:54)

  pET28a是真核表达载体，不适合在原核里表达 。
  原因出在这里？？我记得看过有文章里用pet28a/BL21(DE3)表达系统的啊！

• 尘朵朵 (2014-5-31 15:34:12)

  优化培养条件应该有很多工作可以做，表达条件不同产量相差极大。
  你诱导之前菌浓度合适么？有时候培养稍微过头了点再诱导就不表达了。
  听了感觉好恐怖，一直以来坐表达诱导前测OD值一步都没有太当一回事，也没有做不同OD值诱导的对照，也许是实验做的太不严谨了。另外也可以用乳糖来诱导或培养基中加葡萄糖等是用来优化诱导的还是在IPTG诱导不行时可以尝试的？能不能提供具体一点的信息。
  我现在已经改用pet32a/Rosetta-gammi(DE3)来表达，本想偷点懒快点出结果的，质粒与片断双酶切连接后直接转化Rosetta-gammi(DE3)，为了减少空载体转化的现象，双酶切都过夜双酶切完全，转化DE3后也都长了克隆，按道理长的克隆应该都是阳性的啊，不幸的是挑不出阳性，难道长的这些克隆还是空载体？晕，看来是预速则不达了，得重新转化DH5a再提质粒了。
  谢谢各位的指导。

• 了了 (2014-5-31 15:34:29)

  pET28a是真核表达载体，不适合在原核里表达 。
  ??

• dog002 (2014-5-31 15:34:53)

  QUOTE:

  原帖由 了了 于 2014-5-31 15:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  pET28a是真核表达载体，不适合在原核里表达 。
  ??

  这点可是不对的吧，应该很适合在原核表达吧

• Darcy (2014-5-31 15:35:09)

  pET有真核表达元件么

• hustwb (2014-5-31 15:35:28)

  
  和楼主有着同样的命运!
  首先说明几个问题:
  1:Rosetta2-gammi(DE3)既能够补充稀有密码子(7个),也能够帮助形成二硫键.有利于诱导出活性蛋白.但诱导产量较BL21(DE3)稍低.
  2:pET28a是原核表达表达载体.
  3:Rosetta2-gammi(DE3)是氯霉素抗性,和pET28a的卡那抗性不同,可以筛选.
  我的蛋白也不表达,但只粗摸过诱导条件,更换载体后37度跑胶前后也无差别.
  PMAL和PGEX都构建了,依然没有表达.
  准备细摸条件.希望各位有什么经验教训不吝赐教啊!

• pengke1983 (2014-5-31 15:35:46)

  
  我第一次做表达，也是pET28a/BL21(DE3)系统，重组质粒测序结果没错，酶切检测也没错，可就是表达不出来，不过有一点比较奇怪，转化到BL21后，所挑的克隆，PCR检测都是阴性。后来被老板都快逼疯了，他又是让我换PCR系统，又是换载体系统，我执意不换，他痛骂我一顿。后来，我从另外实验室找了个BL21感受态细胞，一下子就出来了。可问题又来了，我表达的是个酶，表达出来后，全是包含体，几乎没有可溶性的，正在郁闷，摸索中。那位仁兄，能否指点一二？谢谢！