【求助】请教蛋白质疏水层析

最新回复

• zhenxin (2014-7-07 18:18:17)

  疏水性和疏水氨基酸的多少有关,降低疏水蛋白和填料的作用可以再平衡和洗脱缓冲液中加吐温或者乙二醇,PEG,甘油等,都可以增强洗脱能力,同时挂柱子的缓冲液盐浓度别太高,你可以用NaCl代替硫酸铵,它极性要比硫酸铵弱,相同浓度作用力也弱点,洗脱加1%土温或者1-5%乙二醇,PEG,甘油等都可以增强洗脱效果.

• biabiade (2014-7-07 18:19:16)

  
  1.我用的硫酸铵浓度为0.5M，应该不太高。一般采用多大？疏水层析与缓冲液及其浓度有关？
  2.以前，我的发酵液中蛋白浓度不高，穿过峰没有目标蛋白，现在表达量高了，发酵液中蛋白浓度也高，条件一样，为何穿过峰出现目标蛋白？该怎样解决？

• wood533 (2014-7-07 18:21:03)

  
  将纯化填料换成疏水性较弱的应该会好很多。
  穿过峰出现目标蛋白的话可以提高样品中的盐浓度。

• lixi559 (2014-7-07 18:21:38)

  1.我用的硫酸铵浓度为0.5M，应该不太高。一般采用多大？疏水层析与缓冲液及其浓度有关？
  2.以前，我的发酵液中蛋白浓度不高，穿过峰没有目标蛋白，现在表达量高了，发酵液中蛋白浓度也高，条件一样，为何穿过峰出现目标蛋白？该怎样解决？
  
  ====================================================================================================
  
  不同样品浓度不一样,既然你0.2M都洗不下来,那就可以降低到这样的浓度,疏水色谱纯化效果和缓冲液种类,盐种类,配比等都有很大的关系.
  现在浓度高了,也许你载量超过柱子能处理的范围,自然穿透就有,可以降低流速试试,或者少上点样品.

• biabiade (2014-7-07 18:21:55)

  
  一般缓冲液种类,盐种类,配比等都是怎样的关系？采用哪种缓冲液种类,盐？

• plaa (2014-7-07 18:22:13)

  
  一言难尽，你看看疏水色谱的综述吧

• biabiade (2014-7-07 18:22:40)

  请问，乙二醇,PEG,甘油通过CM柱能够除掉？甘露醇感可以降低蛋白疏水性？

• plaa (2014-7-08 10:00:21)

  都可以除去，不带电荷，甘露醇不能降低疏水性。

• dog002 (2014-7-08 10:07:56)

  我做了：降低缓冲液浓度为10mM20mMTris-cl（PH8.5），能够把大部分蛋白洗脱，洗脱液离心，但有蛋白沉淀，是何原因？用水洗，有少部分蛋白，是何原因？如果用磷酸缓冲液和降低PH洗脱，都不理想。我又做了：在缓冲液里加1%土温，洗脱效果和不加土温的10mM20mMTris-cl（PH8.5）差不多。我查过资料：蛋白在酸性条件下稳定，但是用HAC调发酵液上清液PH为4.0，然后离心，有沉淀，PI是6.0，快速调PH，因为蛋白在PI处易沉淀。这又是为何？

• dog002 (2014-7-08 10:08:40)

  
  加土温肯定要比不加洗脱彻底,而且也许可以避免沉淀,你样品疏水性强可以适当增加洗脱液中PEG浓度,这样肯定会不一样的,而且可以避免沉淀.至于后面的不清楚你说的是什么意思.

• biabiade (2014-7-08 10:09:52)

  
  刚才，我把加土温和不加土温的洗脱液离心，结果加土温比不加土温的少。土温影响蛋白质活性？1]

• dog002 (2014-7-08 10:10:36)

  
  什么少,沉淀少还是活性少,本身不影响活性但是也许干扰活性测定,你可以加PEG试试,不一定非要土温

• biabiade (2014-7-08 10:11:04)

  
  加土温比不加土温的10mMTris-cl洗脱液离心，沉淀少。但是刚才我用50%乙酸调加土温的洗脱液到PH4.0，搅拌大概半小时，然后离心，沉淀量稍多点。PEG用多大分子量的？

• dog002 (2014-7-08 10:13:36)

  沉淀少那就对了,PEG你可以选择小分子量的如400-600,也可以选择5000左右,自己定,因为这和样品有关.

• biabiade (2014-7-08 10:13:56)

  
  这和样品有关，这怎样讲？为何调PH，沉淀稍多点？我是开发药得，不是写论文，所以我要确定所加的土温，PEG能够到最后纯品时能够完全除掉，因为每一种药都有质量标准，产品都有一定配方，土温多了会造成溶血。

• dog002 (2014-7-08 10:17:02)

  
  不同pH下蛋白溶解度不同,自然沉淀不一样,如果觉得吐温不保险,可以加PEG,最后不需要除去,具体该怎么做关键看你自己的要求,PEG过柱子可以除去,例如离子交换,凝胶等.

• biabiade (2014-7-08 10:17:25)

  
  今天做了一次，结果很理想，我的样品先调到PH8.5，然后用10mM醋酸缓冲液（PH4.0）+硫酸铵洗脱，逐渐减低硫酸铵浓度洗脱，再用10mM醋酸缓冲液（PH4.0）洗脱，蛋白洗不下来，最后用10mM醋酸缓冲液（PH4.0）+1%土温洗脱，能够洗下来，洗下来的溶液很透明，无沉淀，这样，我直接可过CM柱了，这样解决了调PH造成沉淀。如果CM柱能够把土温去掉，那这样就成功，最后就是活性了，如果活性没影响，就很好。在此还的感谢你的指点！

• dog002 (2014-7-08 10:17:45)

  
  别客气，肯定能去掉吐温。但是我建议你用PEG，因为它本身还可以保护蛋白活性，当然没时间那就算了。

• biabiade (2014-7-08 10:18:03)

  土温影响CM柱对蛋白的吸附？

• dog002 (2014-7-08 10:18:50)

  QUOTE:

  原帖由 biabiade 于 2014-7-8 10:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  土温影响CM柱对蛋白的吸附？

  不影响。