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• quiqui008 (2016-1-12 20:45:37)

  
  楼上的朋友，谢谢你们的精彩讨论，对我有很大的帮助。
  我现在也在做小鼠肾小管上皮细胞的原代培养，方法同pingbo021有些相似，具体如下：
  1.处死后无菌取肾，置于生理盐水的培养皿中(25℃)
  2.分离、剪碎肾皮质并置于8O目不锈钢网筛．研磨并以生理盐水充分冲洗，网下液体倒至100目不锈钢网筛上，收集网上物于装有生理盐水的培养皿中
  3.充分吹吸后，500r/min 3min，观察肾小管情况
  4.离心后弃上清液，加入0.25% 胰蛋白酶1．5～2．0ml，充分吹打使之混匀消化液与离心物，置于37℃振动水浴中，消化20分钟，1500转／分钟×5分钟
  5.小心弃上清后加入5ml含有1O%FBS+DMEM培养液，充分吹打混匀后装入培养瓶中。置孵育箱(37℃5 CO )培养。
  细胞第2－3天就能长出，1周就长的很多了，如附件。
  我看有些文献说肾小上皮细胞能培养8－13代，可是我最多传3代，原来鹅卵石形的就变成了长棱形且细胞死了很多，也不增殖了。我想请教各位战友：肾小管细胞能在体外能增殖培养几代？

  
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• NBA (2016-1-12 20:46:05)

  
  大鼠原代肾小管上皮细胞的取材、培养方法
  取材：
  ①取 Wistar 大鼠断颈法处死，立即置入碘伏液中浸泡 5 分钟。
  ②将大鼠转移入超净工作台，取腰部切口迅速取出肾脏，置于盛有生理盐水的培养皿中清洗并除去包膜和肾蒂组织。
  ③取皮质置于80目筛网上，剪碎成1-2mm3大小组织块，网下放盛有少量生理盐水的培养皿。
  ④用玻璃注射器内芯于80目网上充分研磨组织。
  ⑤收集 80 目网下液体转移至 100 网筛上，用生理盐水冲洗。
  ⑥将100目网上组织用生理盐水冲洗入另一培养皿中，收集置入离心管中。1500 转/分钟离心5分钟，弃去上清。
  2 培养
  ①用1.5ml 0.25%胰蛋白酶重悬沉淀，37℃温箱中消化约10分钟。
  ②加入3ml(双倍量)含有10%胎牛血清RPMI1640中止消化，1500 转/分离心8分钟，弃上清。
  ③加入约3ml RPMI1640 悬浮沉淀，并用吸管充分吹打混匀，接种于培养瓶中。
  ④分离肾小管节段接种于培养瓶后，第一天加入少量培养基，置入37℃,5%CO2孵育箱中静置培养。
  ⑤培养过夜后，第二天加入足量的培养基，静置培养。
  ⑥培养 72 小时后首次换液，以后每两天换液一次。

• XYZQ (2016-1-12 20:55:17)

  
  我感觉你的方法和培养肾小球系膜细胞有点相似，都是取肾皮质的
  里面的杂质细胞是不是太多了？

• NBA (2016-1-12 20:56:11)

  
  在筛网分离后显微镜下可以看到肾小管，培养时可加促上皮细胞生成素，上皮细胞会明显优势生长。相关资料也是这样培养。
  如有兴趣把你培养 肾小球系膜细胞的步骤发来看看，一起讨论下，共同进步。

• NBA (2016-1-12 20:56:52)

  
  肾小球系膜细胞培养
  1. 从大鼠体内取肾脏速度要快，严格无菌操作。
  2. 提取出来的肾小球经IV型胶原酶消化要摸索酶用量，消化时间，肾小球不易消化头。
  3.肾小球接种时，可在培养瓶表面用多聚赖氨酸，胶原，纤连蛋白等包被。我做的前几次，也没有污染，主要问题是肾小球不贴壁，后来一次用多聚赖氨酸包被就成功了。
  4.严格前3天不动培养瓶，可在第五六天首次换液。
  5.有细胞爬出，贴壁生长后，千万要有耐心，我的第一瓶原代细胞张了整整31天。
  6.传代后的系膜细胞长得就挺快了，千万别忘了冻存呀。
  7.用到10代左右，细胞活力就不好了，所以要冻存并尽快用于实验。

• NBA (2016-1-12 20:57:17)

  
  肾小球系膜细胞培养
  是我在其他人那收的，我没做，不知道怎样，但发现和我做的有很大差别的，对上面的提问可做些解释。

• NBA (2016-1-12 20:57:39)

  
  上皮细胞原代培养的一起交流啊，怎么没人做这个吗？

• zbboom (2016-1-12 20:57:55)

  实验步骤
  水合氯醛麻醉大鼠，取腹部中线打开腹腔，腹主动脉放血，取出肾脏。
  放入有D-Hanks液的小烧杯里，并用D-Hanks液冲洗，去除血细胞，之后放入平面皿里，去除肾盂和肾包膜，剪开肾脏，用小刀片刮出肾皮质。
  把肾皮质转移到干净小烧杯里，用眼科剪剪碎，以1mm3大小为度。
  加入少量的D-Hanks液，放到重叠的2层不锈钢筛网上，用注射器针头轻碾组织，同时用D-Hanks液冲洗，一直碾到组织发白即可。
  用D-Hanks液冲洗200目上的筛网组织，使其转移至干净的平面皿里，再用移液管转移到10ml离心管里。
  低速离心组织五分钟、1000r/min。用移液管（吸管或枪）去除上清液，加入0.1%Ⅳ胶原酶3ml,消化时间大概20-30min，边消化边观察（吸取少量的细胞悬液放在细胞计数板上用显微镜下观察，显示肾小球轻度破碎及松动即可），以肾小球散出但又不破碎为宜。
  用20%FCS的DMEM终止消化，可用移液管（吸管或枪）吹打，再迅速离心五分钟，1000r/min。再滴加少许DMEM重悬。
  重悬细胞液，用20ul枪头滴加到25ml的培养瓶瓶底（大约1-2滴）。然后向不同方向轻轻晃动培养瓶使肾小球悬液均匀种植在瓶底,然后迅速翻转培养瓶使培养面朝上，并轻轻晃动使细胞悬液分布均匀。
  用注射器加入5mlDMEM至培养瓶中，放入培养箱中静置。
  过3.5h后轻轻倒转培养瓶，使培养面朝下。四天内勿动培养瓶，第五天换液。可采用半量换液法，即用移液管弃去一半的旧培养液，加入适量新的培养液，目的是给细胞适应环境，在前一两次可采用这种方法。约2周上皮细胞接近长满瓶底,加入嘌呤霉素核苷( 5 mg/L )作用12 h选择性抑制上皮细胞生长。直至约4周时GMC布满培养瓶再进行转种。

• NBA (2016-1-12 20:58:20)

  我们的实验很相似，不过我个人不理解你 “然后向不同方向轻轻晃动培养瓶使肾小球悬液均匀种植在瓶底,然后迅速翻转培养瓶使培养面朝上，并轻轻晃动使细胞悬液分布均匀。过3.5h后轻轻倒转培养瓶，使培养面朝下。” 做法的目的。 还有就是 “放到重叠的2层不锈钢筛网上，用注射器针头轻碾组织。” 可能是笔误吧，应该是内芯。
  祝你早日成功！多交流。

• one (2016-1-12 20:58:42)

  
  楼上的朋友你好：
  我的意思是加一两滴细胞悬液（大概100ul）放在培养面，轻轻晃动使其分布均匀，细胞悬液不能多，否则不容易贴壁，然后翻转，使培养面朝上，再加培养液，放入箱内过3.5个小时，差不多这个时候细胞贴壁了，再翻转培养瓶是培养面朝下，培养细胞。第二个问题是，应该是用针芯的，呵呵，我没表达好。

• one (2016-1-12 20:59:18)

  
  你用的筛网把重叠起来是不是好点呢，直接轻碾80目，用PBS冲洗，收集100目上的，最好用不锈钢筛网吧。培养基用DMEM会好点，胰酶消化应该在镜下观察，时间多少只是个参考
  仅是个人意见，呵呵，多交流

• NBA (2016-1-12 20:59:38)

  近来培养了成骨细胞和肾小管上皮细胞原代培养（都是原代的），培养得还比较顺利，还要继续养细胞，大家一起交流交流啊！
  我的成骨细胞

• NBA (2016-1-12 21:00:17)

  我的细胞培养得还好，只是最近发现有成纤维细胞出现，正准备净化呢。
  不知道你细胞养得怎样了，应该不会难了，细心点就没问题了。

• one (2016-1-12 21:00:36)

  
  你好，很高兴认识你
  刚从实验室回来，今天做了预实验，效果非常不好，遇到了些许困难，不知道你在操作过程可遇到过，大家交流下：
  1 在用针芯轻碾的时候，你是怎么把握力度的，今天我碾的有点重，导致随后的细胞碎片较多。
  2 你是如何把200目筛网的细胞转移到平面皿或是离心管里的,这一步很是难搞，我是把200筛网倒过来，用注射器吸取D-hanks液冲，发觉很难把肾小球冲下来，花了很长时间把冲到皿里，但导致D-hanks液过得，而肾小球很少。我今天只做了一只大鼠。
  3 你在收集筛网上的组织时，量有多少？我的真的很少，导致离心后，就剩一点点在离心管里。
  4 由于肾小球很少，用的胶原酶也就相应的减少，只用了1ML，消化时间只用了15分钟，因为在镜下观察，发现肾小球少的可怜，当时就很郁闷。
  5 还有你是把老鼠断头放血的，血放的可干净？今天用腹主动放血时，血出的不多。
  6 我很是纳闷，为什么剪取的肾皮质很多，到了200目筛网就很少，而且很难把冲下来，这个步骤如何改进？

• ukonptp (2016-1-12 21:01:12)

  你好，很高兴认识你
  刚从实验室回来，今天做了预实验，效果非常不好，遇到了些许困难，不知道你在操作过程可遇到过，大家交流下：
  1 在用针芯轻碾的时候，你是怎么把握力度的，今天我碾的有点重，导致随后的细胞碎片较多。
  2 你是如何把200目筛网的细胞转移到平面皿或是离心管里的,这一步很是难搞，我是把200筛网倒过来，用注射器吸取D-hanks液冲，发觉很难把肾小球冲下来，花了很长时间把冲到皿里，但导致D-hanks液过得，而肾小球很少。我今天只做了一只大鼠。
  3 你在收集筛网上的组织时，量有多少？我的真的很少，导致离心后，就剩一点点在离心管里。
  4 由于肾小球很少，用的胶原酶也就相应的减少，只用了1ML，消化时间只用了15分钟，因为在镜下观察，发现肾小球少的可怜，当时就很郁闷。
  5 还有你是把老鼠断头放血的，血放的可干净？今天用腹主动放血时，血出的不多。
  6 我很是纳闷，为什么剪取的肾皮质很多，到了200目筛网就很少，而且很难把冲下来，这个步骤如何改进？
  ......
  
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  1、不需要放血，断颈处死即可，背部快速取出肾脏，简洁、方便、省时。
  2、收集的肾小球数目不多原因：取皮质太少、研磨不足、转移丢失太多。
  3、收集筛网上的肾小球时，可以用尖嘴的吸管吸取少量hanks液，在冲洗筛网的同时再吸回去，转移至新的50ml离心管中，重复数次，直到收集干净。冲刷最上面筛网的底部，收集到中间筛网，可以减少肾小球损失。
  4、每个肾脏可以培养一瓶原代系膜细胞，一只老鼠培养2瓶。

• ukonptp (2016-1-12 21:02:22)

  我正在原代培养肾小管上皮细胞，希望大家一起交流讨论下心得共同进步啊！
  预祝你培养成功！
  
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  我觉得关键在于原代小管上皮细胞营养培养基的配制，分离并不难，但是要摸索出适合原代上皮细胞生存的条件和培养基配方，很不容易。

• one (2016-1-12 21:02:38)

  
  1、不需要放血，断颈处死即可，背部快速取出肾脏，简洁、方便、省时。
  2、收集的肾小球数目不多原因：取皮质太少、研磨不足、转移丢失太多。
  3、收集筛网上的肾小球时，可以用尖嘴的吸管吸取少量hanks液，在冲洗筛网的同时再吸回去，转移至新的50ml离心管中，重复数次，直到收集干净。冲刷最上面筛网的底部，收集到中间筛网，可以减少肾小球损失。
  4、每个肾脏可以培养一瓶原代系膜细胞，一只老鼠培养2瓶。
  1、不放血是不是影响肾小球的纯度呢？
  2、我也是用一只大鼠分装两瓶，但是肾小球很少，好像系膜细胞本身占皮质的比例就很少，有的战友是两只大鼠装一瓶
  3、楼上的战友对你收集筛网上的肾小球的步骤还是不太清楚，能否讲述清楚点。
  4、是否需要用多聚赖氨酸包被培养瓶？

• 子衿青青 (2016-1-12 21:02:58)

  
  1、如果放血的话，是不是用生理盐水或PBS冲一下会更好呢？理论上可能会好一些，但我们实际操作表明，不放血，收集肾小球后载玻片观察浓度在90%左右，还不错。
  2、我用的是1%明胶铺的培养瓶：1ml。
  3、具体说一下筛网上肾小球的收集：
  首先，准备2个50ml离心管，其中一个装满4℃预冷的0.9% NaCl（我用的是生理盐水）。然后倾斜筛网，用小吸管（带红吸头无刻度的那种） 吸取一定量的生理盐水，将肾小球逐渐冲刷至斜面下方区域，使其聚集。每次冲洗的时候，都回吸一部分（因为生理盐水不可能迅速完全漏掉，会在筛网上短暂停留，这时候就迅速回吸，就把肾小球吸到滴管里了），将回吸的液体打入另一50ml离心管。如此反复操作，逐渐把筛网冲刷干净，同时也将肾小球转移到离心管内了。（在这个操作之前，可以用小吸管先冲刷第一个筛网的底面，因为可能会有很多滤过的肾小球粘在上面，通过多次冲刷，将其冲至中间筛网上。）

• 子衿青青 (2016-1-12 21:03:22)

  这是今天分离的肾小球图片，可以看一下：

  
  18502746.snap.jpg

• 子衿青青 (2016-1-12 21:03:46)

  放大倍数

  
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